Наночастицы гидрофобных природных соединений как адъюванты

• Автор: Гаврилова, Лариса Арсентьевна
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 112 с. : ил.

Содержание
1. Список сокращений
2. Введение
3. Обзор литературы. Наночастицы как адъюванты
3.1. Введение. Классификация адъювантов по механизму их действия
3.2. Эмульсии
3.2.1. Коммерческие адъювантные препараты на основе эмульсий
3.2.1.1. Адъюванты на основе эмульсий «вода в масле»
3.2.1.2. Адъюванты на основе эмульсий «масло в воде»
3.3. Липосомы и виросомы
3.4. Сапонины и ИСКОМы
3.5. Полимерные наночастицы
3.6. Неорганические наночастицы
3.7. Влияние размеров частиц адъювантов на свойства вакцин
3.8. Заключение
4. Обсуждение результатов
4.1. Введение
4.2. Методы исследования
4.3. Получение наночастиц из природных соединений
4.3.1. Получение наночастиц на основе тритерпеноидов бересты
4.3.1.1. Характеристика наночастиц из тритерпеноидов бересты
4.3.1.2. САНЧ из СТБ с мирамистином и олеиновой кислотой
4.3.1.3. Влияние кофеата бетулина на формирование САНЧ и их стабильность
4.3.1.4. Стадии формирования сферических аморфных наночастиц
4.3.2. Получение наночастиц на основе дигидрокверцетина
4.3.3. Получение наночастиц на основе гликосфинголипидов
4.4. Исследование биологических свойств наночастиц
4.4.1. Взаимодействие САНЧ с компонентами крови: клетками, белками и метаболитами
4.4.1.1. Взаимодействие САНЧ с клетками крови
4.4.1.2. Взаимодействие САНЧ с белками крови
' 4.4.1.3. Взаимодействие САНЧ с билирубином
4.4.2. Исследование адъювантных свойств наночастиц
4.4.2.1. Экспериментальные вакцины против гепатита В
4.4.2.2. Экспериментальные вакцины против вируса гриппа
4.4.3. Исследование токсичности НЧ in vitro
4.4.3. l.MTT-тест
4.4.3.2. Окрашивание трипановым синим
4.4.3.3. Оценка цитотоксичности с использованием проточной цитометрии
4.4.3.4. Выявление окислительного стресса
4.4.3.5. Оценка гемолитической активности
4.5. Разработка и испытание экспериментальных установок для получения сферических
аморфных наночастиц

4.5.1. Установки для получения САНЧ из СТБ
4.5.2. Разработка методов контроля
4.5.2.1. Определение концентрации САНЧ в дисперсиях
4.5.2.2. Определение концентрации ТГФ в дисперсиях САНЧ
4.5.3. Подбор криопротектора для лиофилизации САНЧ из СТБ
5. Экспериментальная часть
5.1. Материалы и методы
5.2. Получение наночастиц из природных соединений
5.2.1. Получение НЧ на основе тритерпеноидов бересты
5.2.1.1. САНЧ без модификатора по «стандартной» методике
5.2.1.2. САНЧ с модификатором (олеиновой кислотой или мирамистином)
5.2.1.3. САНЧ из СТБ, меченные 3-метоксибензантроном
5.2.1.4. Влияние pH среды на формирование САНЧ
5.2.1.5. Влияние состава СТБ на формирование САНЧ
5.2.1.6. Стадии формирования САНЧ
5.2.2. Получение НЧ на основе ДГК
' 5.2.2.1. Дисперсии дигидрокверцетина
5.2.2.2. Дисперсии ДГК с мирамистином
5.2.3. Получение НЧ на основе ГСфЛ и мирамистина
5.2.3.1. Методика определения «зоны эквивалентности»
5.2.3.2. Отработка способа и порядка прибавления компонентов дисперсии
5.2.3.3. НЧ из ГСфЛ и мирамистина
5.2.3.4. НЧ из ГСфЛ и мирамистина с добавлением ДГК
5.3. Образцы для биологических испытаний адъювантной активности
5.4. Взаимодействие САНЧ с компонентами крови
5.4.1. Взаимодействие САНЧ с клетками крови
5.4.2. Взаимодействие САНЧ с белками крови
5.4.3. Взаимодействие САНЧ с билирубином
5.5. Культивирование клеток

5.5.2. Jurkat
5.6. Токсикологические исследования наночастиц in vitro
5.6.1. Оценка цитотоксичности наночастиц с помощью МТТ-теста
5.6.1.1. Использование адгезионной культуры клеток линии HeLa
5.6.1.2. Использование суспензионной культуры клеток линии Jurkat
5.6.2. Оценка жизнеспособности клеток методом окрашивания трипановым синим
5.6.3. Оценка цитотоксичности дисперсий с помощью цитофлуориметрии
5.6.3.1. Окрашивание клеток пропидий йодидом
5.6.3.2. Окрашивание клеток флуоресцеин диацетатом
5.6.4. Выявление окислительного стресса
5.6.5. Оценка гемолитической активности наночастиц
5.7. Разработка экспериментальных установок для получения САНЧ. Методы получения
САНЧ отличные от «стандартной» методики
5.7.1. Установка с дроссельным элементом смешения
5.7.2. Смеситель закрытого типа с мешалкой
5.7.3. Ультрафильтрация
5.7.4. Получение САНЧ многоступенчатым методом
5.8. Разработка методов контроля

5.8.1. Определение концентрации САНЧ в дисперсиях
5.8.2. Определение концентрации ТГФ в дисперсиях САНЧ
5.9. Подбор криопротектора для лиофилизации САНЧ
6. Выводы
7. Благодарности
8. Список литературы

антигену-белку. Для изменения заряда САНЧ их модифицировали добавлением мирамистина или олеиновой кислоты.
Для создания САНЧ, модифицированных олеиновой кислотой или мирамистином необходимо было подобрать наилучшее с точки зрения размера частиц и стабильности препарата соотношение СТБ/модификатор. Были приготовлены и исследованы серии нанодисперсий СТБ с различным содержанием модификаторов: 0.025, 0.05, 0.1, 0.3, 0.5 и 2% (от массы СТБ).
Для дисперсий САНЧ с мирамистином (0.1 и 0.5%) и олеиновой кислотой (0.1 и 2%) были сделаны электронные микрофотографии. На электронных микрофотографиях помимо частиц сферической формы в дисперсиях с модификаторами присутствовали плоские структуры, похожие на гибкие листы, характерные для бетулина (рис. 11). Несмотря на присутствие в дисперсии САНЧ с мирамистином (0.5 %) частиц сферической формы (рис. 11, В) рис. 11, Г объясняет тот факт, что дисперсия не стабильна. В образце присутствуют большие агрегаты, образованные сферическими частицами из СТБ, а также плоские структуры бетулина. Также не стабильна и дисперсия с наибольшим исследованным количеством олеиновой кислоты (2%) (рис. 11, Е).
Рис. 11. Электронные микрофотографии дисперсий САНЧ СТБ с мирамистином 0.1% (Б) и 0.5% (В, Г) от массы СТБ; олеиновой кислотой 0.1% (Д) и 2% (Е) от массы СТБ и контрольной дисперсии СТБ (А); масштабный отрезок 50 нм.