Митохондрия как критическое звено в ответе растительной и дрожжевой клетки на тепловое воздействие

• Автор: Рихванов, Евгений Геннадьевич
• Шифр специальности: 03.01.05
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Иркутск
• Количество страниц: 371 с. : ил.

Оглавление
1. ВВЕДЕНИЕ
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Роль синтеза белков de novo в развитии индуцированной термотолерантности
2.1.1. Механизмы гибели клетки при тепловом шоке
2.1.2. Теплолюбивость и термотолерантность
2.1.3. Индуцированная термотолсрантность
2.1.4. Индуцированная термотолерантность и синтез БТШ
2.1.5. Факторы, влияющие на индуцированную термотолерантность
2.1.6. Механизмы индуцированной термотолерантности, независимые от синтеза БТШ
2.2. Общая характеристика БТШ
2.3. Белок теплового шока Hspl04p/Hspl01p
2.3.1. Общая характеристика Hspl04p S. cerevisiae и HsplOlp A. thaliana
2.3.2. Роль Hspl04p/Hspl01p в индуцированной термотолерантности
2.3.3. Hspl04p/Hspl01p восстанавливает агрегированные белки
2.3.4. Роль Hspl04p/Hspl01p в обычных условиях
2.3.5. Структура Hsp 104p/Hsp 101 р
2.3.6. Механизм функционирования Hsp 104p/Hsp 10lp
2.4. Семейство белков Hsp70p
2.4.1. Общая характеристика белков семейства Hsp70p
2.4.2. Разнообразие и локализация белков семейства Hsp70p
2.4.3. Роль белков семейства Hsp70p в индуцированной термотолерантности
2.4.4. Структурные и функциональные особенности семейства белков Hsp70p
2.4.5. Механизм функционирования Hsp70p
2.5. Hsp90p
2.6. Низкомолекулярные (малые) белки теплового шока
2.7. Регуляция экспрессии генов БТШ. Транскрипционные факторы
2.7.1. Фактор теплового шока
2.7.2. Транскрипционные факторы Msn2p и Msn4p S. cerevisiae
2.8. Механизм активации транскрипционных факторов при тепловом стрессе
2.8.1. Денатурационная теория активации ФТШ
2.8.2. Фосфорилирование ФТШ
2.8.3. Другие механизмы транскрипционной активации ФТШ
2.8.4. Регуляция активности транскрипционных факторов Msn2p/Msn4p 5. cerevisiae
2.9. цАМФ-зависимая сигнальная система
2.9.1. Компоненты цАМФ-зависимого сигнального пути
2.9.2. Фенотипические проявления понижения и повышения активности цАМФ-ПКА

2.9.3. Изменение уровня цАМФ при тепловом стрессе и связь с синтезом БТШ
2.9.4. Как регулируется цАМФ-ПКА?
2.9.5. Сигнальная система цАМФ-ПКА и активность митохондрий
2.9.6. Сигнальная система цАМФ-ПКА и программированная гибель клеток
2.10. Активация экспрессии генов БТШ в результате генерации АФК
2.10.1. Повышение уровня АФК сопровождается экспрессией генов БТШ
2.10.2. АФК и активация транскрипционных факторов
2.10.3. Источники генерации АФК
2.10.4. АФК как активатор экспрессии БТЯЕ-регулируемых генов 5. сегег/л'ае
2.11. Кальциевая сигнальная система
2.11.1. Кальций-связывающие белки
2.11.2. Тепловой стресс вызывает повышение уровня кальция в цитозоле
2.11.3. Повышение уровня кальция сопровождается развитием индуцированной
термотолерантности и экспрессией БТШ
2.11.4. Кальций влияет на активность транскрипционных факторов
2.11.5. Связь между гомеостазом внутриклеточного кальция и экспрессией ЭТМЕ-
регулируемых генов у дрожжей
2.11.6. Механизм поступления кальция в клетку
2.12. Роль фитогормонов в регуляции экспрессии генов БТШ
2.12.1. Салициловая кислота
2.12.2. Монооксид азота
2.12.3. Абсцизовая кислота, жасмоновая кислота и этилен
2.13. Выводы из обзора литературы, постановка цели и задач исследования
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Объект исследования и условия культивирования
3.2. Определение температурных параметров роста
3.3. Определение жизнеспособности
3.4. Концентрации агентов
3.5. Определение дыхательной активности
3.6. Схема обработки митохондриальными ингибиторами и разобщителями при изучении их
эффекта на термотолерантность и экспрессию БТШ
3.7. Определение активности каталазы
3.8. Выделение суммарного белка
3.9. Выделение цитоплазматической и митохондриальной белковых фракций
3.10. Одномерный электрофорез
3.11. Окраска и обесцвечивание гелей
3.12. Вестерн-блоттинг
3.13. Выделение суммарной ДНК

3.14. ОТ -ПЦР-анализ
3.15. Измерение потенциала на внутренней митохондриальной мембране
3.16. Измерение продукции АФК
3.17. Люминесценция экворина
3.18. Статистическая обработка данных
4. РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1. Зависимость между скоростью роста и базовой термотолерантностью дрожжей
4.1.1. Сравнение термотолерантности и теплолюбивости у различных видов дрожжей
4.1.2. Влияние тиамина на теплолюбивость и термотолерантность дрожжей D. vanrijiae
4.1.3. Сравнение термотолерантности и теплолюбивости у мутантов S. cerevisiae с
нарушением Са2+гомеостаза
4.2. Митохондрии и тепловой шок
4.2.1. Эффект митохондриальных ингибиторов на дыхательную активность дрожжей
4.2.2. Сравнение термотолерантности видов дрожжей, различающихся по типу
энергетического метаболизма
4.2.3. Эффект митохондриальных ингибиторов на термотолерантность дрожжей
4.2.4. Эффект альтернативной оксидазы на термотолерантность дрожжей
4.2.5. Эффект мутации petite на термотолерантность S. cerevisiae
4.3. Активность митохондрий при тепловом шоке
4.3.1. Влияние теплового шока на продукцию АФК
4.3.2. Влияние повышения температуры на уровень дыхательной активности
4.3.3. Влияние повышения температуры на изменение потенциала внутренней
митохондриальной мембраны
4.4. Параметры гибели клетки при тепловом шоке
4.4.1. Влияние циклогексимида на термотолерантность дрожжей S. cerevisiae
4.4.2. Динамика гибели клеток A. thaliana и S. cerevisiae после теплового шока
4.4.3. Тепловой шок вызывает выход цитохрома с из митохондрий
4.5. Протекторная роль БТШ при тепловом шоке
4.5.1. Роль Hspl01p/Hspl04p в развитии индуцированной толерантности
4.5.2. Гибель клеток A. thaliana при тепловом шоке и синтез БТШ
4.5.3. Гибель клеток S. cerevisiae при тепловом шоке и синтез БТШ
4.5.4. Влияние теплового стресса на выход цитохрома с и HspöOp из митохондрий при
тепловом шоке
4.5.5. Влияние теплового стресса на продукцию АФК и длительность гиперполяризации внутренней митохондриальной мембраны при тепловом шоке в клетках дрожжей 5. cerevisiae

4.6. Митохондриальная регуляция экспрессии генов БТШ
4.6.1. Митохондриальная регуляция экспрессии гена Hspl04p S. cerevisiae

Очевидно, что между двумя NBD доменами в одном мономере существует еще и аллостерическое взаимодействие. Мутация в NBD2, снижающая скорость гидролиза АТФ, но не влияющая на связывание АТФ, также вызывала значительное снижение гидролитической активности в NBD1 домене (Hattendorf, Lindquist, 20026). Поэтому, функционирование NBD2 домена необходимо для стимуляции гидролиза в NBD1 домене. С другой стороны, медленная скорость гидролиза NBD2 домена определяет время связывания субстратного белка с шапероном, необходимое для эффективной белок ремодулирующей активности Hspl04p, которая, в свою очередь, определяется скоростью гидролиза АТФ в NBD1 домене (Doyle et al., 2007). Полагают, что комплексная регуляция гидролиза АТФ в доменах NBD1 и NBD2 приводит к периодичному изменению конформации Hspl04p, что необходимо для его дезагрегирующей функции (Hattendorf, Lindquist, 2002а).
Хотя к настоящему моменту нет точного представления о пространственной структуре Hspl04p/Hspl01p, сходство строения и функций этого белка с бактериальными белками позволяет прогнозировать модель структуры Hspl04p/Hspl01p на основе кристаллической структуры белка ClpB Thermus thermophilius (Lee et al., 2003). Согласно этой модели, шаперон собирается в кольцеобразный гексамер с двумя ярусами. То есть, олигомер представляет собой два кольца, каждое из которых содержит шесть сайтов связывания АТФ. ААА+ модули ориентированы по отношению друг к другу, как голова к хвосту, таким образом, что NBD1 и NTD домены одной субъединицы находятся над NBD2 доменом той же самой субъединицы. Аденозин 5’-(Р,у-имидо)-трифосфат (негидролизуемый аналог АТФ, который использовали при построении модели) связывается между соседними субъединицами, а аргининовый палец NBD2 домена контактирует с фосфатом, связанным с NBD1 доменом, обеспечивая структурную основу кооперативности между двумя ААА+ модулями (Hattendorf, Lindquist, 20026). Средний домен (MR) выступает наружу и дает гексамеру вид двухлопастного пропеллера, если смотреть на гексамер сверху. Шесть субъединиц образуют центральный канал, который, вероятно, играет важную роль в процессе дезагрегации (Lee et al., 2003).
2.3.6. Механизм функционирования Hspl04p/Hspl01p
2.3.6.1. Взаимодействие HsDl04v/Hspl01p с субстратным белком
Безусловно, для выполнения своих функций Hsp 104p/Hsp 101р должен взаимодействовать с агрегированными белками. Однако, хотя Hspl04p/Hspl01p растворяет образовавшиеся при тепловом шоке белковые агрегаты (Glover, Lindquist,