Исследование структурных основ лигандной специфичности рецепторов цитокининов

• Автор: Стеклов, Михаил Юрьевич
• Шифр специальности: 03.01.05
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 150 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ПРЕДИСЛОВИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Методы изучения активного сайта рецептора
1.1. Фотоаффинная модификация
1.2. Химическая модификация боковых групп аминокислот
2. История открытия и особенности строения агонистов и антаг онистов рецепторов цитокининов
3. Идентификация индивидуальных рецепторов цитокининов
4. Доменный состав рецепторов цитокининов
5. Система передачи цитокииинового сигнала и участвующие в ней белки
6. Локализация рецепторов цитокининов
7. Особенности лигандной специфичности рецепторов цитокининов
8. История изучения и особенности третичной структуры рецептора АНК
9. Точечные мутации в рецепторах цитокининов и их влияние на передачу сигнала
10. Молекулярные аспекты действия цитокининов
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Реактивы и материалы
1.2 Синтез азидопроизводных цитокининов
1.3 Фотоаффинная модификация рецепторов цитокининов
1.4 Модификация отдельных амвинокислот в рецепторах цитокининов
2. Модельные системы
2. 1 Модельные системы на основе E. coli
2.2 Модельные системы на основе трансгенного арабидопсиса
2.3 Модельная система на основе амаранта
3. Сайт-специфичный мутагенез методом ПЦР
4. Получение химически-компетентных клеток E. coli
5. Химическая трансформация E. coli
6. Выделение плазмид из E. coli
7. Рестрикция
8. Получение химически компетентных клеток
Agrobacterium tumefaciens GV3
9. Трансформация химически компетентных

Agrobacterium tumefaciens GV3
10. Трансформация растений Nicotiana benthamiana
11. Получение сферопластов
12. Выделение мембран из E. coli
12.2 Выделение мембран растительных клеток
13. Радиолигандный метод анализа связывания цитокининов с рецепторами в составе бактерий и сферопластов
14. Радиолигандный метод анализа связывания цитокининов с рецепторами в составе растительных или бактериальных мембран
15. Анализ активности ß-глюкуронидазы (GUS) в
проростках PARR5:GUS арабидопсиса
16. Биотест на цитокининовую активность с проростками амаранта (амарантовый биотест)
17. Компьютерное моделирование сайта связывания цитокининов
18. Математические и статистические методы анализа
19. Биоинформатический анализ последовательностей белка
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
Синтез азидопроизводных цитокининов и фотоаффинная модификация рецепторов цитокининов
Модификация отдельных аминокислот
Биоинформатический анализ сенсорного модуля рецепторов цитокининов
Экспрессия полноразмерного рецептора АНК2 и исследование его лигандной специфичности
Молекулярное моделирование сенсорных модулей рецепторов цитокининов из арабидопсиса и кукурузы: структурное обоснование лигандной специфичности
Молекулярные модели гомологов CHASE домена АНК
Обоснование лигандной специфичности шести цитокшшновыхрецепторов из арабидопсиса и кукурузы, основанное на молекулярном докинге различных цитокининов
Влияние N9-pu6o3iunipouauuH цитокининов на их связывание с рецептором
Докипг азидопроизводных цитокининов: 2-азидо-б-бензиламинопурина и 8-азидо-6-бензиламинопурина
Общее заключение
Направленный мутагенез лиганд-связывающего сайта рецептора ZmHKl
ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
БЛАГОДАРНОСТИ

Оказалось, что при добавлении к мутанту по генам ARR3-6 гена ARR5 дикого типа чувствительность к цитокининам снижалась до уровня контрольных растений. При добавлении гена ARR5 с заменой консервативного аспартата (D87) на аланин чувствительность не падала, а при введении гена ARR5 с заменой D87E возникало частичное снижение чувствительности к цитокининам (То et al., 2007). Таким образом была доказана необходимость фосфорилирования ARR типа А для осуществления ими негативной регуляции цитокининового ответа. Вероятнее всего, регуляторы ответа типа А и В конкурируют за связывание фосфатов, находящихся на фосфотрансмиттсрах АИР, и таким образом регуляторы ответа типа А блокируют цитокининовый сигнал, осуществляя отрицательную обратную связь (Рис. 8). Это предположение достаточно хорошо коррелирует с данными по локализации ARR типа А и В. В то время как ARR типа В локализуются исключительно в ядре (Lohrmann et al., 1999, 2001; Sakai et al., 2000; Hwang & Sheen, 2001; Ilosoda et al., 2002; Mason et al., 2004), для ARR типа А наблюдаются различные места локализации: ARR5-7 и 15 локализуются в ядре, a ARR4 и 16 были обнаружены как в ядре, так и в цитоплазме (Hwang & Sheen, 2001; Imamura et al., 2001; Kiba et al., 2002), что потенциально позволяет регуляторам ответа типа А акцептировать высокоэнергетический фосфат с молекулы АИР еще до проникновения в ядро.
Стоит заметить, что регуляторы ответа типа А могут выполнять и другие важные роли вне передачи цитокининового сигнала, например ARR4 отвечает за стабилизацию активной формы фитохрома В (Werner & Schmülling, 2009).
Регуляторы ответа типа С были выделены в отдельную группу. Так же как ARR типа А, они обладают только респверным доменом. Интересно отмстить, что по своей аминокислотной последовательности ARR типа С ближе к ресиверным доменам гибридных гистидинкиназ (АНК4), чем к RR других типов (Kiba et al., 2004). Было показано, что у регуляторов ответа типа С (на примере ARR22), в отличие от типа А, уровень транскрипции не является цитокинин-зависимым. Фенотип мутантов с оверэкспрессией генов ARR22 внешне напоминал wol, но при этом ещё и являлся полностью стерильным. Также было продемонстрировано, что ARR22 может подвергаться фосфорилированию in vitro при инкубировании с