Получение и характеристика моноклональных антител для экспресс-анализа бактериальных токсинов

• Автор: Шошина, Наталья Сергеевна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 120 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ.
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1.1 .Бактериальные токсины
1.1.1 .Возбудитель холеры и холерный токсин
1.1.2.Энтеротоксигенные штаммы кишечной палочки и термолабильный энтеротоксин Escherichia coli
1.2.Методы детекции возбудителей инфекционных заболеваний
1.3.Иммунохимические методы детекции бактериальных токсинов
1.3.1 .Поликлональные антитела
1.3.2.Моноклональные антитела
1.3.3.Рекомбинантные антитела
1.3.4. Связывающие белки на основе альтернативных каркасных белков
1.3.5. Аптамеры
1.3.6.0сновные параметры иммуноаналитеских систем
1.3.7.Форматы и типы иммуноанализа
1.3.7.1.Твердофазный иммуноферментный анализ
1.3.7.2.Флуоресценция с временным разрешением
1.3.7.3.Иммунохроматографи я
1.3.7.4.ИммуноПЦ Р
1.3.8.Иммунохимические методы анализа холерного токсина и термолабильного токсина E. coli
1.3.9.Флуоресцентный иммуноанализ с применением хМАР технологии (Luminex) —
принцип и характеристика
1.3.10.Особенности получения моноклональных антител к бактериальным токсинам
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1.1.Получение моноклональных антител к холерному токсину
3.1.2.Получение моноклональных антител к термолабильному энтеротоксину
E. coli
3.1.3.Выделение и очистка моноклональных антител
3.1.4.Характеристика МА к СТ
3.1.5.Характеристика МА к LT
3.1.6.Подбор пар МА для детекции СТ методом «сэндвич»-ИФА

3.1.7.Подбор пар МА для детекции LT методом «сэндвич»-ИФА
3.1.8.Детекция и количественное определение холерного токсина и термолабильного энтеротоксина E. coli в образцах различной природы методом «сэндвич»-ИФА.
3.1.9.Подготовка образцов смывов со слизистой оболочки носоглотки для детекции и количественной оценки в них холерного токсина и термолабильного энтеротоксина
E. coli методом «сэндвич»-ИФА на планшетах
3.2.Разработка биплексной тест-системы на основе хМАР технологии для детекции
холерного токсина и термолабильного энтеротоксина E. coli
3.2.1. По лучение конъюгатов микросфер с МА к СТ и LT
3.2.2.Определение оптимальных концентраций детектирующих антител
3.2.3.Определение минимальной детектируемой концентрации СТ и LT в буфере методом биплексного иммунофлуоресцентного анализа с применением хМАР технологии
3.2.4.Биплексный анализ СТ и LT в буфере
3.2.5. Изучение перекрестной активности моноклональных антител полученных к холерному токсину и термолабильному энтеротоксину E. coli со специфическими антителами к стафилококковым токсинам А и В
3.2.6.Детекция и количественное определение холерного токсина и термолабильного энтеротоксина E. coli в продуктах питания в формате хМАР-анализа
3.2.7. Детекция и количественное определение холерного токсина и термолабильного энтеротоксина E. coli в смывах со слизистой носоглотки человека в формате хМАР -анализа
3.2.8.Детекция и количественное определение холерного токсина и термолабильного
энтеротоксина E. coli в воде из открытого водоема в формате хМАР - анализа..
Заключение
ВЫВОДЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. Научно-технический прогресс предоставляет ранее невиданные возможности не только для развития новых высокотехнологичных областей науки и техники, но и для развития средств широкомасштабного терроризма. Особую опасность несет в себе биотерроризм. Развитие молекулярной биологии и биотехнологий приводит к осознанию неизбежности этого вида терроризма в близком будущем и, следовательно, к необходимости создания как глобальной, так и национальной стратегии защиты. В современных условиях в любое время, в любой точке мира может начаться эпидемия, возбудителями которой оказываются новые или уже хорошо известные занесенные из эндемичных очагов микроорганизмы. Примером могут служить атипичная пневмония (ТОРС-синдром), болезнь легионеров, астраханская риккетсиозная пятнистая лихорадка и др. Микроорганизмы и их токсины могут стать причиной эпидемий не только вследствие намеренной диверсии, но и в силу непредсказуемости эпидемических и экологических последствий их неконтролируемого попадания во внешнюю среду.
Методы диагностики инфекционных заболеваний и мониторинга объектов окружающей среды и продуктов питания долгое время базировались, главным образом, на основе классических схем микробиологического анализа и сводились к выделению возбудителя в чистой культуре и последующей его идентификации. Стандартные микробиологические методы - культивирование бактерий и микроскопические исследования - трудоемки и долгосрочны, поэтому на сегодняшний день они вытесняются генно-инженерных методами, такими как ПЦР. Эти методы используются для выявления патогенов. Для детекции вырабатываемых этими патогенами токсинов широко используются методы иммунохимического анализа (ИХА). Они обладают высокой специфичностью и чувствительностью. Важным фактором, определяющим специфичность и чувствительность ИХА, являются антитела. Используются три вида антител - поликлональные, моноклональные и рекомбинантные. Для создания высокочувствительных специфических тест-систем количественного определения токсинов широко используются «сэндвич»-вариант иммуноферментного анализа (ИФА), в котором антитела используются в качестве как связывающих, так и детектирующих антител. Пары используемых антител могут состоять только из моноклональных антител или из моноклональных и поликлональных антител.
Развитие методов на основе ИХА идет в различных направлениях. Одно из направлений заключается в разработке сенсоров для детекции биологических агентов на поверхности различных субстратов, таких как оптоволокно, стеклянные капилляры, лунки для микротитрования, чипы с интегральными микросферами, магнитные микрочастицы.

Благодаря небольшому размеру, микросферы имеют высокое отношение поверхности к объему, суспензия микросфер остается жидкой, и реакции протекают в ней с высокой скоростью.
хМАР-технология предлагает 100 отличающихся по окраске типов микросфер. При создании пула микросфер используют комбинации двух красителей. Каждый тип микросфер демонстрирует уникальную флюоресценцию в области красного и инфракрасного света. Все микросферы, имеющие конкретное соотношение цветов, принадлежат к одному типу, который идентифицируется в соответствии со своим ID-номером, и каждый тип микросфер имеет свою локализацию на карте (так называемый спектральный адрес). Такое разнообразие типов микросфер позволяет проводить до 100 различных тестирований в одном реакционном объеме. При этом разные типы микросфер можно объединять, и даже в этом случае они сохраняют свои отличительные особенности.
Особенностью считывающей аппаратуры для технологии хМАР является наличие двух лазеров, которыми оборудован цитометр: зеленого (кристалл иттрий-алюминиевого граната с излучением 532 нм - для возбуждения флуоресценции фикоэритрина) и красного диодного (возбуждает два флуорохрома, окрашивающих микросферы) [2].
МИА с использованием микросфер активно применяется, как в клинических исследованиях, так и в самых разных областях биологии [2, 111]. Классическими стали исследования цитокинов. МИА цитокинов выполняли в разных лабораториях и на разном оборудовании [112-115]. Применение технологии хМАР позволило разработать систему для одновременного тестирования 15 цитокинов [115]. С помощью флуоресцентных микросфер тестируют у новорожденных врожденный гипотиреоз [116] и уровень антител к трем антигенам вируса иммунодефицита человека [117], осуществляют тестирование HLA-антигенов 1 и 2 классов [118]. Данная технология применима для серотипирования многочисленных штаммов Streptococcus pneumoniae [119]. В этих случаях получают конъюгаты микросфер со штаммоспецифическими полисахаридами. Жани с соавторами [120] предположили, что мультиплексный анализ на основе флуоресцентных микросфер, как нельзя лучше, подходит для процедуры скрининга, требующей повышенной производительности, как в случаях обследования донорской крови, обследовании населения при подозрении массовых заболеваний, детских болезней, сопровождающихся сыпью и повышенной температурой и др.
МИА с применением хМАР технологии успешно использовали для скрининга в сыворотке крови болезнетворных токсинов и антител против них [121, 122,123].
При проведении массового вакцинирования детей раннего возраста для сокращения количества требуемых инъекций обычно используют комбинированные вакцины. Например, вакцины против дифтерии и столбняка обычно дополняют вакциной против коклюша, либо против гепатита В, против Haemophillus influenzae типа b, который вызывает тяжелые формы