Химически активные ДНК в исследовании белков репарации ДНК: идентификация Ku-антигена как белка, взаимодействующего с апуриновыми/апиримидиновыми сайтами

• Автор: Ильина, Екатерина Сергеевна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 132 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1.1. ОСНОВНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ Ku-АНТИГЕНА
1.1.1. Структура Ки и функциональные особенности его доменов
1.1.2. Свойства Ku-антигена
1.1.2.1. Димеризация и функции субъединиц
1 Л.2.2. Взаимодействие с ДНК
1.2. ФУНКЦИИ Ки
1.2.1. Репарация двухцепочечных разрывов ДНК
1.2.2. Роль Ku-антигена в сохранении целостности теломерных участков.
1.2.3. Регуляция транскрипции генов
1.2.4. АТР-азная и геликазная активности Ки
1.2.5. Участие Ки в антиапоптотических процессах
1.2.6. Роль мембранной формы Ки
1.2.6.1. Влияние мембранной формы Ku-антигена на адгезию и инвазию клеток
1.2.6.2. Роль Ku-антигена в проникновении Rickettsia conorii и парвовируса В19 в клетки человека
1.3. РОЛЬ Ки В КАНЦЕРОГЕНЕЗЕ
1.3.1. Роль различных форм Ки
1.3.2. Мутации Ки, приводящие к злокачественной трансформации клеток
1.4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. МАТЕРИАЛЫ
2.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.2.1. Приготовление экстрактов
2.2.1.1. Приготовление цельноклеточных экстрактов
2.2.1.2. Приготовление ядерного экстракта из клеток К
2.2.2. Введение [32Р]-метки в 5'-конец олигонуклеотида и формирование ДНК-дуплексов

2.2.3. Гель-электрофорез нуклеиновых кислот и белков и количественная обработка данных
2.2.3.1. Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях
2.2.3.2. Электрофорез в ПААГ в нативных условиях
2.2.3.3. Электрофорез по Леммли
2.2.3.4. Количественная обработка распределения радиоактивности в гелях
2.2.4. Синтез фотоактивируемых ДНК, катализируемый Ро1 р
2.2.5. Создание ДНК-структур, содержащих фотоактивируемую группу в середине цепи
2.2.6. Создание ДНК-структур, содержащих сШМР и 32Р в середине цепи
2.2.7. Создание ДНК-структур, с Ыо-сШМР на З'-конце сШМР-содержащей цепи (Ыо-АР-ДНК)
2.2.8. Синтез фотоактивируемых ДНК, катализируемый эндогенными ДНК-полимеразами клеточных экстрактов и определение доли удлинения праймера (Уа)
2.2.9. Фотоаффинная модификация белков клеточных экстрактов
2.2.10. Получение ДНК-дуплексов, содержащих АР-сайты
2.2.11. Модификация белков клеточных экстрактов АР-ДНК
2.2.12. Идентификация продуктов модификации белков клеточных экстрактов АР-ДНК с помощью иммунопреципитации
2.2.13. Идентификация белка экстракта клеток К562, взаимодействующего с АР-ДНК с помощью МАЦЛ-ТОР-МБ
2.2.13.1. Модификация белков экстракта клеток К
2.2.13.2. Выделение комплексов белок-ДНК с помощью аффинной хроматографии на Б1:гер1ау1с1т MagneSphere (МВ)
2.2.13.3. Подготовка проб для МАЬЭ1-ТОР-М8 анализа
2.2.14. Влияние конкурентных ДНК на эффективность модификации белков клеточного экстракта НеЬа АР-ДНК
2.2.15. Оценка стабильности адцуктов белок-ДНК
2.2.16. Проверка связывания ДНК-дуплексов с белками экстракта клеток НеЬа методом задержки в геле
2.2.17. Идентификация белков клеточных экстрактов, взаимодействующих с АР-ДНК, методом задержки в геле
2.2.18. Влияние ДНК-ПК на расщепление АР-ДНЮ, по положению АР-сайта, АР-эндонуклеазой
2.2.19. Оценка содержания Ku80 в клеточном экстракте с помощью dot-ELISA.... 62 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ БЕЛКОВ КЛЕТОЧНЫХ
ЭКСТРАКТОВ С ФОТОАКТИВИРУЕМЫМИ ИНТЕРМЕДИАТАМИ РЕПАРАЦИИ ДНК
3.1.1. Синтез фотоактивируемых ДНК in situ ДНК-полимеразами клеточного экстракта HeLa и ядерного экстракта семенников крупного рогатого скота (анализ субстратных свойств различных аналогов dNTP)
3.1.2. Фотоаффинная модификация белков клеточных экстрактов
фотоактивируемыми ДНК, синтезированными in situ
3.1.3. Исследование белков системы ЭРО в экстрактах клеток человека методом фотоаффинной модификация
3.2. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ БЕЛКОВ КЛЕТОЧНЫХ
ЭКСТРАКТОВ С ДНК, СОДЕРЖАЩИМИ АР-САЙТЫ
3.2.1. Модификация белков экстрактов клеток человека ДНК, содержащими АР-сайты
3.2.2. Идентификация белка, формирующего сшивки с АР-сайтами
3.2.3. Функциональные аспекты взаимодействия Ки с АР-ДНК
3.2.3.1. Специфичность взаимодействия Ки с АР-ДНК
3.2.3.2. Влияние основания напротив АР-сайта на взаимодействие Ки с АР-ДНК
3.2.3.3. Проверка активности Ku-антигена в отношении АР-сайтов
3.2.4. Взаимодействие Ku-антигена с ДНК, имитирующими кластерные повреждения
3.2.5. Оценка стабильности комплексов Ku-антиген*АР-ДНК
3.2.6. Влияние Ku-антигена на активность АР-эндонуклеазы
3.2.7. Использование АР-ДНК-зоидов для определения содержания Ки80 в экстрактах клеток
3.2.7.1. Оценка содержания Ки80 в экстрактах клеток меланом
3.2.7.2. Идентификация белков экстрактов клеток меланом,
модифицированных АР-ДНК
3.3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
клетках, происходящих из клеток указанных типов, не удивительно. Остаются открытыми вопросы: обусловлено ли появление мембранной формы Ки в случае других опухолевых клеток их трансформацией и какой механизм обеспечивает перемещение Ки на поверхность клеток. Решение этих вопросов представляет важно для определения роли мембранной формы Ки в метастазировании и развитии рака [28].
Имеются также данные о том, что Ки80 может выступать как рецептор соматостатина [164]. Основываясь на этих данных можно предположить, что Ки может выступать как отрицательный регулятор клеточного цикла, так как соматостатин является ингибитором пролиферации клеток. Изменения внутриклеточной локализации Ки контролируется различными внешними гуморальными и клеточными стимуляторами роста [164, 165]. Такие стимуляторы включают межклеточные контакты, TGF-ß, среду без сыворотки или Са2+, а также аналоги соматостатина [165]. Локализация Ки на поверхности клеток объясняет наличие антител против него в крови больных с различными аутоиммунными заболеваниями.
1.2.6.2. Роль Ки-антигена в проникновении Rickettsia conorii и парвовируса В19 в клетки человека
Недавно, было показано, что выход Ки70 на поверхность клеточной мембраны индуцируется некоторыми патогенами, в частности Rickettsia conorii, и помогает их проникновению в клетку хозяина [32]. Риккетсии проникают в клетку, связываясь с мембраной, индуцируя фагоцитоз, и выходят из фагосомы в цитоплазму [166]. В клетки млекопитающих, не способных к фагоцитозу, R. conorii проникает другим способом. Бактерия, взаимодействуя с клеточной мембраной клетки хозяина, привлекает Ки70 и убиквитинлигазу к поверхности плазматической мембраны. Убиквитинлигаза катализирует убиквитинилирование Ки70, что, как предполагается, индуцирует внутриклеточный сигнал, который вызывает "перестройку" клеточного актина и захват бактерии [166].
Еще один патоген — парвовирус В19 - проникает в клетки благодаря мембранной форме Ku-антигена. Было обнаружено, что проникновение этого вируса в клетки обусловлено мембранной формой Ки80 и увеличивается при гипоксии [33]. Как уже было отмечено выше, гипоксия стимулирует выход Ки80 на поверхность клетки [159]. Антитела против Ки80 блокируют связывание В19 с клеточной мембраной [33]. Таким образом, взаимодействие с Ku-антигеном является важным для проникновения R. conorii [32] и парвовируса В19 [33] в клетки хозяина.