Спектрально-флуоресцентные свойства KFP и использование этого белка для создания сенсоров, основанных на индуктивно-резонансном переносе энергии

• Автор: Русанов, Александр Леонидович
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 123 с. : ил.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ:
ДТТ - 1,4-дитиотреитол.
ИПТГ - изопропил-/Ш-тиогалактопиранозид.
ПААГ-электрофорез — стандартный гель-электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.
ПЦР — полимеразная цепная реакция.
Трис - Трис(гидроксиметил)метиламин.
ФБ -флуоресцирующие белки.
ЭДТА - динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты.
BFP - голубой флуоресцирующий белок.
CFP - циановый флуоресцирующий белок.
cpFP - циркулярно-мутированный флуоресцирующий белок.
DMEM - среда Игла, модифицированная Дульбекко.
EGFP (EBFP, ECFP, EYFP) - улучшенный зеленый (голубой, циановый, желтый) флуоресцирующий белок.
FRET - индуктивно-резонансный перенос энергии.
GFP - зеленый флуоресцирующий белок.
KFP - разгорающийся флуоресцирующий белок.
МЕМ - метод максимальной энтропии.
PA-GFP — фото активируемый зелёный флуоресцирующий белок.
PAFP’s - фотоактивируемые флуоресцирующие белки.
PS-CFP - фотопереключаемый циановый флуоресцирующий белок.
So и Si - поверхности потенциальной энергии основного и первого возбужденного электронных состояний, соответственно.
YFP - желтый флуоресцирующий белок.

Содержание
1. ВВЕДЕНИЕ
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Структура GFP-подобных белков
2.2. Применение цветных флуоресцирующих белков
2.3. Фотоактивируемые флуоресцирующие белки
2.4. Фотохимическая конверсия
2.5. Процессы протонирования-депротонирования
хромофора в GFP
2.6. Роль планарности и цис-транс изомеризации в фото-
физических свойствах флуоресцирующих белков
2.7. Влияние белкового окружения хромофора
на свойства флуоресцирующих белков
2.8. Квантово-химическое моделирование процесса
разгорания KFP
2.9. Индуктивно-резонансный перенос энергии между
флуоресцирующими белками
2.10. Выбор флуоресцирующих белков для метода FRET
2.11. Способы измерения FRET
2.11.1. Спектральный метод
2.11.2. Измерение времён жизни фпуорещенции
2.12. Генно-инженерные конструкции для FRET
2.13. Межмолекулярный FRET
2.14. Внутримолекулярный FRET

2.15. Структура линкеров
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Используемые реагенты и оборудование
3.2. Выделение, очистка и трансформация компетентных
клеток E. coli плазмидной ДНК
3.3. Экспрессия и выделение белков с 6-гистидиновым
тагом
3.4. Электрофорез белков
3.5. Титрование белков '
3.6. Спектральные измерения
3.7. Кинетические измерения
3.7.1. Кинетикиразгорания и тушения флуоресценции KFP
3.7.2. Необратгшая фотоконверсия KFP
3.8. Метод получения генетической конструкции для оценки эффективности индуктивно-резонансного
переноса энергии
3.8.1. Амплификация генов красных флуоресцирующих
белков с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР)
3.8.2. Клонирование генов красных флуоресцирующих белков в экспрессирующихся в про- и
эукариотических клетках векторах
3.8.3. Встраивание литерных последовательностей, содержащих сайт узнавания каспазы-
между парой красных флуоресцирующих белков
3.8.4. Конструирование плазмиды pET22b/TagRFP-23-KFP

(собс твенно FRET) , или сразу оба (% FRET может быть подсчитан). В случае FRET эмиссия донора уменьшается, а эмиссия акцептора растёт.
2) Фотовыцветапие акцептора: возбуждение донора и детекция эмиссии донора до и после фотовыцветания акцептора. Фотоинактивация акцептора обычно требует наличия мощного лазера с длиной волны излучения, соответствующей максимуму возбуждения акцептора.
Существует несколько вариантов реализации данного подхода. Первый -FRAP (Fluorescence recovery after photobleaching) - основан на необратимом фотообесцвечивании FP на небольшом участке клетки и наблюдением за последующим восстановлением флуоресценции на этом участке за счёт диффузии флуоресцирующих молекул из необлученных областей клетки. Этот метод позволяет определять такие параметры, как долю мобильной фракции белка и коэффициент диффузии.
В варианте Inverse FRAP облучается вся клетка, за исключением небольшого участка. Наблюдение за уменьшением интенсивности флуоресценции данного участка с течением времени позволяет судить о скорости диффузии частиц из изучаемого участка[111].
Другой подход, основанный на фотовыцветании флуоресцирующго белка — FLIP (Fluorescence Loss In Photobleaching). В данном методе небольшой участок клетки подвергается облучению, в то время как ведётся регистрация уменьшения флуоресценции целой клетки, что позволяет установить границы различных клеточных органелл и компартментов [111].
Метод, называемый FLAP (Fluorescence Localization After Photobleaching) предполагает использование двух флуоресцирующих белков в качестве меток. Фотообссцвсчивание одного из них позволяет следить за всем пулом объектов, подвергшихся облучению.
Полученные данные могут быть представлены в виде эффективности переноса энергии: либо в процентном соотношении 0-100%, либо в шкале от 0 до 1, где 0 указывает на отсутствие взаимодействий, а 1 на максимальные взаимодействия. В реальных живых клетках и в большинстве экспериментов