Структурное исследование НАД+-зависимых формиатдегидрогеназ из различных организмов

• Автор: Шабалин, Иван Григорьевич
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 133 с. : ил.

Содержание
1. ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
2. ВВЕДЕНИЕ
3. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
3.1. Физиологическая роль ФДГ в различных организмах
3.1.1. Микроорганизмы
3.1.2. Высшие растения
3.2. Пространственная структура ФДГ
3.2.1. Структуры апо- и холо-форм РьеФДГ
Пространственная организация РїєФДГ
Структурные изменения РяеФДГ при переходе к закрытой конформации
Связывание кофермента и структура каталитического центра РбєФДГ
Субстратный канал
3.2.2. Структура комплекса РяеФДГ с АДФР
3.2.3. Тетрагональная кристаллическая модификация апо-формы РьеФДГ
3.2.4. Структуры комплексов РвеФДГ с ионом формиата
3.2.5. Структуры мутантных форм РзеФДГ
3.2.6. Структура апо-формы СЬоФДГ
3.3. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей ФДГ
3.4. Молекулярные и кинетические свойства ФДГ в растворе
3.4.1. Стабильность
3.4.2. Формально-кинетический механизм
3.4.3. Кинетические параметры
3.4.4. Субстратная специфичность
3.4.5. Коферментная специфичность
3.5. Механизм ферментативного катализа ФДГ
3.5.1. Переход ФДГ в закрытую конформацию
3.5.2. Исследования изотопных эффектов формиатдегидрогеназной реакции
Дрожжевые ФДГ
Бактериальные ФДГ
3.5.3. Сайт-направленный мутагенез остатков активного центра ФДГ
3.5.4. Изучение механизма действия ФДГ методами in silico
Квантово-механические расчеты в газовой фазе и симуляции молекулярной динамики.... 54 Расчеты гибридными методами квантовой механики и молекулярной динамики (QM/MM)
3.6. Практическое применение ФДГ
4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Поиск и выравнивание аминокислотных последовательностей
Объекты исследования
Кристаллизация
Рентгеноструктурный эксперимент, решение и уточнение пространственных структур
5. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
5.1. Структуры холо- и апо-форм МолФДГ
5.1.1. Холо-форма МогФДГ
Общий анализ структуры
Дополнительные С-концевые остатки
Димерный контакт

Каталитический центр и связывание кофермента
5.1.2. Апо-форма МогФДГ
Общий анализ структуры
Каталитический центр и сайт связывания кофермента
Конформационный переход МогФДГ из открытой конформации в закрытую
5.2. Структура лпо-формы МсжФДГ в закрытой конформации
Общий анализ структуры
Каталитический центр
Сайт связывания адениновой части кофермента
Возможные причины кристаллизации апо-МогФДГ в закрытой конформации
Роль С-концевого фрагмента 375-399, кофермента и субстрата/ингибитора в переходе бактериальных ФДГ к закрытой конформации
5.3. Структуры холо- и апо-форм Ала ФДГ
5.3.1. Холо-форма АгаФДГ
Общий анализ структуры
Димерный контакт
Каталитический центр и связывание кофермента
Коферментная специфичность
5.3.2. Апо-форма АгаФДГ
Общий анализ структуры
Каталитический центр и сайт связывания кофермента
Конформационный переход АгаФДГ из открытой конформации в закрытую
5.4. Структура холо-формы МолФДГ с атомным разрешением
Преимущества атомного разрешения
Сравнение структур холо-МогФДГ при разрешениях 1.1 и 1.95
Структура активного центра
6. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

/. ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
ФДГ - НАД+-зависимая формиатдегидрогеназа
РэеФДГ — ФДГ из метилотрофных бактерий Pseudomonas sp.
РйеФДГ GAV — мутантная ФДГ Pseudomonas sp.101 (GAV)
РзеФДГ Т7 - мутантная ФДГ Pseudomonas sp. 101 (Т7)
БсеФДГ - ФДГ из пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae Soy ФДГ - ФДГ из высшего растения Glycine max (соя)
АгаФДГ - ФДГ из высшего растения Arabidopsis thaliana
СЬоФДГ - ФДГ из метилотрофных дрожжей Candida Boidinii
МогФДГ — ФДГ из метилотрофных бактерий Moraxella sp. С-
АДФР - аденозиндифосфорибоза
НАД1” - никотинамидадениндинуклеотид
НАДН - никотинамидадениндинуклеотид восстановленный
НАДФ+ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат
НАДФН - никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный
RMSD - среднеквадратичное отклонение
ПЭГ — полиэтиленгликоль
Тт — температура, при которой за 20 мин инактивируется 50%
фермента
В большинстве случаев номера остатков соответствуют первичной структуре РэеФДГ. Если же номер остатка соответствует аминокислотной последовательности ФДГ из другого организма, то он выделен жирным шрифтом (например, А1а213).

3.4.2. Формалыю-кииетический механизм
Все исследованные эукариотические ФДГ катализируют реакцию окисления формиата по упорядоченному кинетическому механизму, при этом первым в активном центре связывается НАД4 [1, 3, 48, 73-76]. В случае бактериальных ферментов реализуется неупорядоченный кинетический механизм с быстрым установлением равновесия между свободным ферментом и двойными комплексами ФДГ-формиат и ФДГ-НАД4 [1, 3, 58, 77, 78]. Высказана гипотеза, что дополнительная петля на N-конце бактериальных ФДГ (Рис. 1) отвечает за протекание ферментативной реакции у этих ферментов по неупорядоченному кинетическому механизму [46].
Молекулы ФДГ из различных организмов функционируют в виде димера, состоящего из двух идентичных субъединиц. Активные центры субъединиц в ФДГ из метилотрофных бактерий и дрожжей функционируют независимо друг от друга [3, 46, 73, 75-77, 79]. Это находится в полным согласии с тем, что индивидуальные субъединицы, стабилизированные в обращенных мицеллах, обладают каталитической активность [80]. Для ФДГ из зерен гороха было показано, что в этом ферменте существует два типа активных центров, отличающихся сродством к формиату и азиду [79]. Исследование кинетических свойств ФДГ из пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae (ЗсеФДГ) показало, что этот фермент представляет промежуточный вариант между ФДГ с независимыми и зависимыми активными центрами. При pH 6.0-8.5 связывание формиата и азида в двух активных центрах БсеФДГ происходит независимо друг от друга, однако при pH >9.0 зависимость скорости реакции от концентрации не подчинялась простой зависимости Михаэлиса-Ментен и соответствовала модели с двумя типами активных центров [46].
3.4.3. Кинетические параметры.
Все ФДГ имеют близкие значения Кт по формиату (3-10 мМ) и НАД4' (35-90 мкМ), причем рекомбинантные ФДГ мало отличаются от нативных ферментов (Таблица 1). Для РбсФДГ более высокое значение Кт по формиату (в два раза) для нативного фермента по сравнению с рекомбинантным связано с тем, что С-конец полипептидной цепи зрелого нативного фермента короче генно-инженерного на 7 аминокислот [63], [81]. Ранее было показано, что нативная РэеФДГ существует в виде нескольких изоформ с различным сродством к формиату, существование которых объяснено частичным протеолизом С-концевых остатков [82]. Рекомбинантная субъединица фермента синтезируется в виде полноразмерного полипептида длиной 400 аминокислот и имеет максимальное сродство к формиату, однако закристаллизовать такую полноразмерную РяеФДГ не удавалось.