Генотоксическое действие долгоживущих радикалов белка, индуцированных рентгеновским излучением

• Автор: Карп, Ольга Эдвиновна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 94 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Активные формы кислорода и окислительный стресс

1.1. Активные формы кислорода

1.1.1. Синглетный кислород

1.1.2. Супероксид-анион радикал

1.1.3. Перекись водорода

1.1.4. Гидроксильный радикал

1.2. Окислительный стресс

Глава 2. Окисление белков

2.1. Реакции окислителей с биологическими мишенями
2.2. Повреждения основной цепи белка. Образование белковых радикалов
2.3. Повреждение боковых остатков аминокислот
2.3.1. Алифатические аминокислотные остатки и остатки
с положительным и отрицательным зарядом
2.3.2. Ароматические остатки
2.3.3. Цистеин и цистин
2.4. Окисление остатков метионина в белках
2.5. Передача повреждения в пределах белковой молекулы и на другие мишени
2.6. Последствия окисления белков
2.6.1. Фрагментация и димеризация
2.6.2. Образование окисленных активных соединений и цепная реакция
2.6.3. Конформационные изменения
2.7. Окисление белков и нарушение энергетического метаболизма
2.8. Деградация окисленных белков
Глава 3. Антиоксидантные свойства некоторых аминокислот и пептидов
3.1. Аминокислоты как природные низкомолекулярные антиоксиданты
3.2. Пептиды как природные внутриклеточные антиоксиданты
ЧАСТЬ И. МЕТОДИЧЕСКАЯ
Глава 4. Материалы и методы исследования
4.1. Материалы

4.2. Методы
4.2.1. Получение крысиного сывороточного альбумина
4.2.2. Обезвоживание творога
4.2.3. Облучение
4.2.4. Животные
4.2.5. Долгоживущие радикалы белка
4.2.6. Иммуноферментный анализ (ИФА)
4.2.7. Микроядерный тест
4.2.8. Тест на выживаемость
4.2.9. Определение перекиси водорода
4.2.10. Определение концентрации гидроксильных радикалов
4.2.11. Определение концентрации растворенного кислорода
4.2.12. Статистический анализ
ЧАСТЬ III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 5. Влияние долгоживущих радикалов белка и аминокислот на образование АФК в водных растворах in vitro
при воздействии рентгеновского излучения
5.1. Образование долгоживущих радикалов белка
5.2. Образование АФК в водной среде под влиянием долгоживущих
радикалов бычьего сывороточного альбумина
5.3. Образование перекиси водорода в водной среде под влиянием
долгоживущих радикалов аминокислот
Глава 6. Генотоксическое действие долгоживущих радикалов
белка, индуцированных рентгеновским излучением
6.1. Образование 8-оксогуанина в ДНК in vitro под действием
долгоживущих радикалов бычьего сывороточного альбумина
6.2. Образование полихроматофильных эритроцитов с микроядрами в клетках красного костного мозга животных под влиянием долгоживущих радикалов белка 61 ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ
Воздействие ионизирующего излучения на живые организмы может происходить как за счет прямого действия - возбуждения и ионизации макромолекул, так и путем косвенного действия - образующихся в результате радиолиза воды высокореакционных свободных радикалов [Кудряшов, 2004]. Преобладающая часть повреждений биополимеров в клетке, индуцированных ионизирующей радиацией, образуется в результате окислительного стресса. Окислительный стресс - это нарушение в биологической системе баланса между прооксидантами и возможностью их нейтрализации в системе антиоксидантной защиты [Halliwell, Gutteridge, 1982]. При воздействии ионизирующего излучения окислительный стресс обусловлен образованием активных форм кислорода (АФК) в результате радиолиза воды [Ward, 1988]. Поскольку АФК, за исключением перекиси водорода, являются короткоживущими продуктами, то этот процесс происходит непосредственно во время облучения.
Для нейтрализации избыточного количества АФК в клетках имеется многофункциональная система антиоксидантной защиты в виде разнообразных перехватчиков радикальных продуктов радиолиза воды, а также ферментных систем нейтрализации радикалов. Увеличение внутриклеточной концентрации АФК свыше возможности их нейтрализации системой антиоксидантной защиты клетки вызывает окислительный стресс, приводящий к повреждениям биологических молекул и необходимости их элиминации или репарации. Возникает необходимость активизации различных защитных и адаптационных клеточных механизмов для преодоления повреждающих последствий окислительного стресса. Определенное количество АФК постоянно образуется в клетке в результате нормальных аэробных биохимических реакций и необходимо для осуществления редокс-регуляции различных клеточных функций. Существенная роль в сигнально-регуляторных клеточных процессах принадлежит перекиси водорода - долгоживущей формы АФК [Stone, Yang, 2006; Forman, Maiorino, Ursini, 2010].
В настоящее время установлено, что при воздействии высоких доз ионизирующей радиации на биологические объекты мишенями являются вода и белки. Белки являются более чувствительной мишенью, чем ДНК и липиды для реакции с гидроксильным радикалом (ОН') - наиболее реакционноспособной АФК [Du, Gebicki, 2004]. Это обусловлено тем, что среди биополимеров содержание белкового компонента в клетке

клеток костного мозга при воздействии ионизирующего излучения [Пулатова и др., 2006]. Для этой аминокислоты установлена также способность предотвращать поражение миокарда крыс, вызванного образованием супероксид-анион радикала [Lass et al., 2002] и развития атеросклероза у кроликов [Hayashi et al., 2005].
Было показано, что лизин, глутаминовая кислота и гистидин способны перехватывать супероксид-анион радикалы [Чистяков и др., 2005]. Для гистидина показана способность к перехвату пероксильных радикалов, предотвращению карбоксилирования белков и образованию белковых сшивок [Деккер, 2000], что коррелирует со свойствами гистидинсодержащих дипептидов.
Результаты, полученные в системе фотоиндуцированного образования синглетного кислорода, свидетельствуют о том, что пролин является эффективным перехватчиком синглетного кислорода [Alia et al., 2001]. Во многих организмах в состоянии стрессовых воздействий происходит накопление этой аминокислоты [Alia, Saradhi, 1993], возможно, как защитная реакция на окислительный стресс. Для пролина также показана способность к предотвращению апоптоза в мутантных штаммах грибов с повышенной генерацией АФК [Chen, Dickman, 2005], что также свидетельствует о его антиоксидантных функциях.
Для некоторых аминокислот получены результаты, указывающие на их способность к химической репарации продуктов одноэлектронного окисления ДНК (однонитевых разрывов и гуанил-радикала) [Milligan et al., 2003, 2004]. Аминокислоты цистеин, тирозин, триптофан и метионин способны к одноэлектронному восстановлению таких повреждений. Пептиды, содержащие тирозин, в комплексе с ДНК способны эффективно предотвращать ее окислительное повреждение под действием ионизирующего излучения [Ly et al., 2006].
Одним из наиболее легко окисляемых остатков в белках является метионин. Он может быть атакован многими АФК, образующимися в биологических системах [Halliwell, Gutteridge, 1984]. По-видимому, остатки метионина действуют в качестве эндогенных антиоксидантов - так назывемых «молекулярных телохранителей» в клетках, защищая стратегически важные аминокислотные остатки, входящие в состав активных центров ферментов, от их окислительной модификации. Окисление Met в МеЮ является обратимым, обеспечивая химическую основу для более эффективного удаления АФК и обеспечения защиту от конкретной молекулы до целой клетки [Luo, Levine, 2009].