Направленное конструирование модифицированных олигонуклеотидов для разработки новых исследовательских и лекарственных средств

• Автор: Зайцева, Марина Алексеевна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 100 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
1. ВВЕДЕНИЕ
2. «БИОЛОГИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ КОНФОРМАЦИОННОГО ПОЛИМОРФИЗМА С-КВАДРУПЛЕКСОВ» (ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР)
2.1 Введение
2.2 И-квадруплексы
2.3 Структура О-квадруплекса
2.4 Биологическая значимость Є-квадруплексов
2.4.1 Взаимодействие с белками
2.4.2 Роль С-квадруплексов в нерасшифрованных участках генома
2.4.3 Теломеры и теломераза
2.5. О-квадруплексные аптамеры
2.5.1 Тромбиновый аптамер
2.5.2 Биологическая активность тромбинового аптамера
2.5.3 Методы повышения стабильности тромбинового аптамера
2.5.3.1 Изменение состава квадруплексного мотива
2.5.3.2. Добавление к структуре дополнительных элементов
2.5.3.3. Модификация оснований, входящих в структуру
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1 Синтез олигонуклеотидов
3.2 Синтез жирнокислотных производных олигонуклеотидов
3.3 Конфокальная флуоресцентная микроскопия
3.4 Фиксация жирнокислотных производных олигонуклеотидов на поверхности живых клеток
3.4.1 Проточная цитометрия
3.4.2 Тест на выживание клеток
3.4.3 Фиксация жирнокислотных производных олигонуклеотидов на поверхности клеток Іигкаї и макрофагов 1774
3.4.4 Жизнеспособность клеток в присутствии жирнокислотных производных
3.5 Исследование физико-химических параметров олигонуклеотидов
3.5.1 Измерение спектров поглощения, флуоресценции и кругового дихроизма
3.5.2 Метод поляризованной флуоресценции ЕЯЗг
3.6 Исследование биологических свойств полученных олигонуклеотидов
3.6.1 Нуклеазный гидролиз
3.6.2 Влияние олигонуклеотидов на скорость свертываемости крови (определение тромбинового времени)

3.6.3 Исследование стабильности олигонуклеотидов в плазме крови
3.7 МА Л.ЛГИ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
4.1 Оптимизация методов получения модифицированных олигонуклеотидов
4.1.1 Жирнокислотные производные олигонуклеотидов
4.1.1 Л Выбор структуры жирнокислотных конъюгатов
олигонуклеотидов
4.1.1.2 Фиксация жирнокислотных производных олигонуклеотидов на поверхности живых клеток
4.1.2. Олигонуклеотиды, несущие тиофосфорильные модификации
ЗАДАННОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ
4.1.2.1 Конструирование тиоаналогов ТВА
4.1.2.2 Синтез модифицированных локально тиофосфорилированных олигонуклеотидов
4.2 Структурно-функциональные свойства тиоаналогов ТВА
4.2.1 Стерическая организация олигомеров
4.2.2 Термодинамические характеристики тиоаналогов ТВА
4.2.3 Влияние локализации тиофосфорильных замен на стабильность олигомеров
4.3 Биологические свойства олигонуклеотидов
4.3.1 Влияние тиоаналогов ТВА на скорость свертываемости крови
4.3.2 Исследование кинетики нуклеазного гидролиза ТВА и его тиоаналогов
4.3.3 Исследование стабильности олигонуклеотидов в плазме крови
5. ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ И РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ
6. СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
7. ПРИЛОЖЕНИЕ (АКТЫ О ВНЕДРЕНИИ В ПРОИЗВОДСТВО РАЗРАБОТОК ДИССЕРТАНТА)

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
FAM - 6-carboxyfluorescein, 6-флуоресцеинил-6-карбоксиамидогексил MALDI MS - Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry, -лазерная десорбционно-ионизационная времяпролетная масс-спектрометрия с участием матрицы NOS - N-гидроксисукцинимид
PBS - Phosphate Buffered Saline, фосфатно-солевой буфер SELEX - Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,
TBA -Thrombin Binding Aptamer, -тромбин связывающий аптамер UTR - untranslated region нетранслируемая часть генома ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография ДМАП - N.N-диметиламинопиридин КД - круговой дихроизм ПААТ - полиакриламидный гель ТВ -тромбиновое время
ЯМР - спектроскопия ядерно-магнитного резонанса

Таким образом, существует большое количество известных биологически активных аптамеров, исследования структуры, стабильности и их связи с биологическими функциями активно продолжается [97].
2.5.1 Тромбиновый аптамер.
Медицина гомеостаза имеет два диаметрально противоположных аспекта. С одной стороны, необходимо разрабатывать препараты, которые препятствуют свертыванию крови, например для проведения сердечнососудистых операций. С другой стороны необходимо бороться с образованием тромбов внутри сосудов, поскольку тромбы вызывают многие опасные заболевания: нестабильную стенокардию (острый коронарный синдром), инфаркт миокарда, ишемический инсульт, тромбозы сосудов нижних конечностей.
В настоящее время основным медицинским препаратом для модуляции гомеостаза является гепарин и его производные. Гепарин имеет как существенные плюсы (низкая цена, наличие антидота протамина), так и существенные минусы. Гепарин взаимодействует со многими белками плазмы крови, поэтому его антикоагуляционная активность малопредсказуема. Гепарин имеет серьезные побочные эффекты: он может индуцировать гипотонию и тромбоцитопению; он способен потенциировать действие физиологических индукторов агрегации тромбоцитов. Еще гепарин медленно выводится из организма, что часто приводит к послеоперационным кровотечениям.