Исследование конформационной подвижности родопсин-подобных рецепторов методами молекулярной динамики и структурной биоинформатики

• Автор: Новиков, Глеб Вадимович
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 150 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность работы
Цель н задачи исследования
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Общие сведенья о белках
1.2. Иерархия белковой структуры
1.3. Структурно-динамические особенности белка (двугранные углы)
1.4. Динамические особенности белков
1.5. Описание 7-ТМ рецепторов, исследованных в настоящей работе
1.6. Пространственная архитектура 7-ТМ рецепторов
1.7. Конформационная динамика 7-ТМ рецепторов
1.8. Развитие основных представлений о функционировании 7-ТМ рецепторов
1.9. Общие представления о конститутивной активности 7-ТМ рецепторов
1.10. Микропереключатели в 7-ТМ рецепторах
1.11. Исследование активации 7-ТМ рецепторов методом молекулярной динамики
1.11.1. Исследование фотоактивации родопсина
1.11.2. Исследование структурной подвижности микропереключателей
1.11.3. Исследование активации гормон-активируемых GPCRs
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БЕЛКОВОЙ ДИНАМИКИ
2.1. Метод молекулярной динамики
2.2. Метод главных компонент
2.3. Управляемая молекулярная динамика. Метод essential dynamics sampling
2.4. Детали расчетов
Исследование структурной подвижности Src-тирознн-киназы методом анализа главных
компонент
Исследование структурной подвижности 7-ТМ рецепторов методом главных компонент.. 67 Исследование структурной подвижности аденозинового Агл рецептора методом
молекулярной динамики
Моделирование молекулярной динамики А2а рецептора в окружении ССЦ-вода
Моделирование молекулярной динамики Агд рецептора в окружении ПОГФ-вода
Расчет сдвига РКа для титруемых аминокислотных остатков рецептора
Моделирование молекулярной динамики аденозинового рецептора в окружении ПОГФ-
вода методом Essential Dynamics Sampling (EDS)
Моделирование p-2-адренорецептора в комплексе с лигандами
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Исследование конформационной подвижности водорастворимых белков методом анализа главных компонент
3.2. Исследование конформационной подвижности родопсин-подобных рецепторов методом анализа главных компонент
3.3. Исследование конформационной подвижности аденозинового Aja рецептора методом равновесной молекулярной динамики
3.4. Исследование конформационной подвижности аденозинового рецептора в окружении липиды-вода методом “управляемой” молекулярной динамики
3.5. Исследование влияния связывания лигандов на конформационную динамику р-2-адренорецептора методом “управляемой” молекулярной динамики
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Приложение 1.СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ
7-ТМ - семи-трансмембранный;
А - ангстремм;
АГК - анализ главных компонент ВП- внеклеточная петля;
ВНП- внутриклеточная петля;
ГК- главная компонента;
МВШ- модель Моно-Ваймена-Шанже;
МД- молекулярная динамика; не- наносекунда; нм- нанометр; пс- пикосекунда;
ПОГФ - 1-Пальмитоил-2-олеил-глицеро-3-фосфат-етаноламин;
СКО- среднеквадратичное отклонение;
ТМ- трансмембранный;
ТМ1, ТМ I - первый трансмембранный домен (одна из семи а-спиралей);
ТМД- трансмембранный домен;
PDB- белковый банк данных (protein data bank);
EDA- Essential Dynamics Analysis ( метод анализа основной динамики);
EDS- Essential Dynamics Sampling (метод перебора основной динамики);
EXC- Extracellular (loop)- обычно служит для обозначения внеклеточных петель рецептора; GPCR- G-protein-coupled receptors (рецепторы, сопряженные с действием G-белка);
1C - Intracellular (loop) - обычно служит для обозначения внутриклеточных петель рецептора; РСА - Principal Components Analysis (метод анализа главных компонент);
PC- principal component (главная компонента);
RMSD- среднеквадратическое отклонение (СКО);
TMD- Transmembrane Domain (трансмембранный домен, обычно служит для обозначения одной из а-спиралей рецептора) р2-ар- p-адренергический рецептор;
А2А-аденозиновый рецептор подкласса А2А;
'vmtiii

Приложение Ъ.Осповные определения.
Обозначение аминокислот. Существует два альтернатиных способа обозначения аминокислотных остатков в 7-ТМ рецепторах. Наиболее традиционный способ- нумерация остатков от N- к С- концу полипептидной цепи. Например, Lys-15, означает остаток лизина в 15 позиции, относительно N-конца. Кроме того, существует альтернативная нумерация, предложенная Баллестеросом и Вейнштейном (Ballcsteros-Weinstein nomenclature). Согласно этой номенклатуре, каждому аминокислотному остатку приписывается два номера, разделенных точкой (например, Тгр-6.48). При этом, первое число соответствует номеру а спирали, в которой расположен этот остаток, а второе (двузначное) число отражает степень консервативности данного остатка среди родопсин-подобных 7-ТМ рецепторов. Во втором случае, наиболее консервативный остаток имеет индекс х.50. Таким образом, остаток Тгр-6.48 обозначает высококонсервативный остаток триптофана из VI спирали рецептора. Подобная система удобна для обозначения высококонсервативных остатков в 7-ТМ рецепторах (например, микро-переключателей), имеющих неидентичное положение в полипептидной цепи различных рецепторов. Например, в вышеуказанном примере Тгр-6.48, в случае родопсина соответствует остатку Тгр-275, а в случае аденозинового рецептора- Тгр-265.
Аллостерия- феномен структурного и энергетического сопряжения между пространственно-удаленными участками белка. Например, в случае, когда связывание лиганда в ортостерическом сайте приводит к конформационным изменениям во внутриклеточной области рецептора, считается что два данных участка аллостернчески сопряжены.
Миозюествениая эффективность- способность одного рецептора активировать несколько различных молекул-эффекторов, в зависимости от связывания различных лигандов. В этом случае говорят, что рецептор способен осуществлять сигнализацию, по различным путям, переключение между которыми связано со стабилизацией его различных конформаций. Например, сигнализация, в случае p-2-адренергического рецептора может протекать либо через Gs, либо через Gi- белки. В первом случае активация рецептора сопровождается повышением уровня цАМФ, а во втором- его снижением. Существуют рецепторы с более выраженной “множественной эффективностью”, в рамках которой связывание различных лигандов активирует принципиально различные пути сигнализации.
Микпо-исрсключатели- высококонсервативные остатки 7-ТМ рецепторов, для которых характерна повышенная степень динамики их боковых групп (ротамерная изомеризация по двугранному углу у-l). Для всех 7-ТМ рецепторов обнаружено, по крайней мере, три подобных структурных элемента: (1) солевой мостик (ионный замок), образуемый остатками Arg- 3.50 (мотив DRY) и Glu - 6.32 из цитоплазматической области третьей, а так же шестой спиралей, соответственно; (2) ротамерный переключатель- высококонсервативный остаток триптофана (Тгр-6.48, мотив CWxP), расположенный в районе лиганд-связывающей области; (3) остаток Туг-7.53 (мотив NPxxY) из седьмой спирали рецептора.
Конститутивная (спонтанная, базовая) активность - доля активного (апо) рецептора, относительно его общей активной фракции, не вызываемая связыванием молекулы агониста.

иминокислот в средней части а-спиралей нарушает регулярную систему водородных связей между нх атомами главного остова, существенно повышая их структурную гибкость [102, 103]. Таким образом пролины, локализованные в средней области ТМ а-спиралей, обычно выполняют роль молекулярных шарниров. Анализ кристаллографических структур родопсина выявил пространственную близость шарнирных пролинов к рстиналь-связывающему карману фоторецептора. При этом, наиболее крупномасштабные движения отдельных а-спиралей родопсина вызывались смещением крупного Р-иононового кольца фотоизомернзующегося ретнналя [69] . Наиболее же загадочным являлся способ передачи подобных локальных структурных колебаний, происходящих на уровне боковых групп аминокислот ретиналь-связывающего кармана, на удаленную от него цитоплазматическую поверхность рецептора, ответственную за связывание G-белка. Появление пространственных структур родопсина, соответствующих его активному ( мета-ii) подсостояншо (например, pdb ids 3pqr, Зсар или 2x72), частично пролило свет на этот вопрос. В ходе сравнения активных и неактивных (pdb id lgzm) форм фоторецептора было показано существование нескольких высококонсервативных остатков, называемых “микро-переключателями” (micro-switches) [64, 65]. Благодаря системе нековалентных взаимодействий боковых групп этих аминокислот, осуществляется стабилизация отдельных а-спиралей 7-ТМ рецепторов. Таким образом, связывание агонистов обычно приводит к разрыву одного из нескольких подобных взаимодействий, стабилизируя неактивное подсостояние рецептора. С другой стороны, агонисты могут активировать различные комбинации микропереключателей, стабилизируя различные активные конформации рецептора. Последнее хорошо соответствует модели “множественной эффективности”, описывающей функциональность гормон-активнруемых GPCR. До недавнего времени, наиболее детальные исследования микропереключателей были выполнены на родопсиновом фоторецепторе. Было показано, что ротамерная изомеризация крупных ароматических боковых групп, а так же образование электростатических контактов, приводят к стабилизации различных фотоинтермедиатных состояний фоторецептора.
Более детальный анализ кристаллографических структур гормон-активируемых рецепторов позволил обнаружить три основных внутримолекулярных переключателя (Рис. 6). Прежде всего, показано существование специфического ионного замка (ionic lock) между третьей и шестой спиралями рецепторов [104]. Образование этого взаимодействия стабилизовало неактивную конформацию рецептора. Анализ кристаллографических структур родопсина показал, что последнее было связано с образованием солевого мостика между боковой группой остатка аргинина (Arg-135) из E/DRY мотива ТМЗ, а так же глутамата (Glu-