Гетерогенность карбоангидразной активности тилакоидов гороха

• Автор: Руденко, Наталья Николаевна
• Шифр специальности: 03.00.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 127 с. : ил.

1. ВВЕДЕНИЕ
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА УГЛЕКИСЛОТЫ
2.2. СЕМЕЙСТВА КАРБОАНГИДРАЗ
2.2.1. а-семейство карбоангидраз
2.2.2. /1-семейство карбоангидраз
2.2.3. у-семейство карбоангидраз
2.2.4. д- и е- семейства карбоангидраз
2.3. ОСОБЕННОСТИ МЕХАНИЗМА КАТАЛИЗА ОБРАТИМОЙ РЕАКЦИИ ГИДРАТАЦИИ С02 КАРБОАНГИДРАЗАМИ РАЗНЫХ СЕМЕЙСТВ
2.3.1. Механизм действия а-КА
2.3.2.0-КА. Предположительная модель катализа
2.3.3. у-карбоангидраза. Особенности каталитической реакции
2.4. МЕХАНИЗМ ИНГИБИРОВАНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ КАРБОАНГИДРАЗ
2.5. ЗАМЕЩЕНИЕ ЦИНКА НА ДРУГИЕ МЕТАЛЛЫ В АКТИВНОМ ЦЕНТРЕ КАРБОАНГИДРАЗ
2.6. РАСПРОСТРАНЕНИЕ И РОЛЬ КАРБОАНГИДРАЗ
2.6.1. Прокариоты
2.6.2. Эукариоты. Животные
2.6.3. Водоросли
2.6.4. Высшие СЗ растения
2.6.5. С4 растения
2.7. ПРЕОБРАЗОВАНИЕ ЭНЕРГИИ В ТИЛАКОИДНОЙ МЕМБРАНЕ
2.7.1. Организация фотосинтетического аппарата высших растений
2.7.2. Роль протонов и неорганического углерода в регуляции энергопреобразования
2.8. КАРБОАНГИДРАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ
ТИЛАКОИДНЫХ МЕМБРАН
2.8.1. Тилакоидная карбоангидраза водорослей
2.8.2. Карбоангидразная активность тилакоидов высших растений
3. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. ВЫДЕЛЕНИЕ ТИЛАКОИДОВ
3.2. ВЫДЕЛЕНИЕ ФРАГМЕНТОВ ТИЛАКОИДНЫХ МЕМБРАН, ОБОГАЩЕННЫХ ФОТОСИСТЕМОЙ 1 ИЛИ 2 (ФС1-МЕМБРАН И ФС2-МЕМБРАН)
3.3. ПОЛУЧЕНИЕ ЭКСТРАКТА РАСТВОРИМЫХ БЕЖОВ ЛИСТЬЕВ ГОРОХА
3.4. ИЗМЕРЕНИЕ КА АКТИВНОСТИ

3.5. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ПРЕПАРАТОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ
ХЛОРОПЛАСТОВ ГОРОХА
3.5.1. Условия проведения электрофореза
3.5.2. Определение КА активности в ПААГ
3.5.3. Анализ гелей на присутствие белка
3.5.4. Подбор условий разрешения пигмент-белковых комплексов в ПААГ
3.6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ХЛОРОФИЛЛА В ПИГМЕНТ-БЕЛКОВЫХ ПОЛОСАХ В ГЕЛЕ
3.7. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЗЕЛЁНЫХ ПОЛОС
3.8. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ БЕЛКА
3.9. ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ БЕЛКОВ, ПЕРЕХОДЯЩИХ В РАСТВОР ПРИ ИНКУБ АЦИИ ТИЛАКОИДОВ С ТРИТОНОМ ПРИ ОТНОШЕНИИ ТРИТОН/ХЛОРОФИЛЛ, РАВНОМ
4. РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1. РАСПРЕДЕЛЕНИЕ КА АКТИВНОСТИ В ТИЛАКОИДАХ
4.2. ХАРАКТЕРИСТИКИ ФС1 -МЕМБРАН И ФС2-МЕМБРАН
4.3. КА АКТИВНОСТЬ ФС1 -МЕМБРАН
4.3.1. Характеристики КА активности ФС1-мембран
4.3.2. Карбоангидразная активность ФС1-мембран в ПААГ
4.3.3. Влияние ингибиторов на КА активность ФСГмембран
4.4. КАРБОАНГИДРАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ ФС2-МЕМБРАН
4.4.1. Характеристики карбоангидразной активности ФС2-мембран
4.4.2. Карбоангидразная активность ФС2-мембран в ПААГ
4.4.3. Влияние ингибиторов на карбоангидразную активность ФС2-мембран
4.5. СВИДЕТЕЛЬСТВА ПРИСУТСТВИЯ В ПРЕПАРАТАХ МЕМБРАН, ОБОГАЩЁННЫХ ФС 1 И ОБОГАЩЁННЫХ ФС2, РАЗНЫХ НОСИТЕЛЕЙ КА АКТИВНОСТИ
4.6. СВИДЕТЕЛЬСТВА ПРИСУТСТВИЯ В ТИЛАКОИДАХ РАСТВОРИМОГО НОСИТЕЛЯ КАРБОАНГИДРАЗНОЙ АКТИВНОСТИ
4.6.1. Карбоангидразная активность тритоновых экстрактов тилакоидов
4.6.2. Карбоангидразная активность белков супернатанта 12
5. ОБСУЖДЕНИЕ
6. ВЫВОДЫ
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

АА - ацетазоламид (5-ацетиламино-1,3,4-тиадиазол-2-сульфонамид)
АДФ - аденозиндифосфат
АТФ - аденозинтрифосфат
ВОК - водоокисляющий комплекс
ДТТ - дитиотреитол (трео-2,3-дигидрокси-1,4-димеркаптобутан)
ДМ - додецилмальтозид
КА - карбоангидраза
ОГ - октилглюкозид
тКА - карбоангидраза тилакоидов
НАДФ+ - окисленный никотинамидаденин-динуклеотидфосфат НАДФН - восстановленный никотинамидаденин-динуклеотидфосфат ПААГ - полиакриламидный гель
Рубиско - рибулозобисфосфат-карбоксилаза/оксигеназа
Снеорг- - неорганический углерод
ССК - светособирающий комплекс
Тритон/хл - тритон/хлорофилл
ФС1 - фотосистема
ФС2 - фотосистема
ФЭУ - фотоэлектронный умножитель
Хл - хлорофилл
ЭА - этоксизоламид (6-этокси-2-бензотиазолсульфонамид)
Р680 - первичный донор электронов РЦ ФС1 Р700 - первичный донор электронов РЦ ФС2 ДА - фотоиндуцированные изменения поглощения
насыщенной СОг при 0°С, и измеряя время изменения pH от 8.3 до 7.8. Контролем служило время спонтанной гидратации в тех же условиях с добавлением соответствующей среды вместо образца. Активность КА выражали в мкмолях Н+ на мг Хл или белка за минуту с учетом буферной емкости сред и образцов, определяемой титрованием 0.1 М НС1. При анализе действия ингибиторов образцы инкубировали с ними в измерительной ячейке в течение 2 мин до начала реакции. Сульфамидные ингибиторы КА этоксизоламид (6-этокси-2-бензотиазолсульфонамид, Sigma) и ацетазоламид (N-5-сульфамоил-1,3,4,-тиадиазолилацетамид, Sigma) растворяли в диметилсульфоксиде.
При измерении КА активности кусочков гелей их растирали в охлажденной ступке со стеклом в присутствии 2 мл 18 мМ вероналового буфера и после центрифугирования при 12000 х g, в течение 10 мин определяли КА активность полученного супернатанта. В качестве контроля использовали элюат участка геля без исследуемого материала.
3.5. Электрофорез препаратов, выделенных из хлоропластов гороха.
3.5.1. Условия проведения электрофореза.
Электрофорез проводили по методу (Peter & Thomber, 1991) при 4° в 7%, 13% и 15% ПАА цилиндрических гелях, содержащих 12.4 мМ трис-глициновый буфер, pH 8.5 и 20% глицерин. Электродным буфером служил 12.4 мМ трис-глицин, pH 8.3. Верхний электродный буфер содержал 0.2% дерифат-160 (n-лаурил-Р-иминодипропионат натрия). Электрофорез проводили в темноте в холодной комнате в течение 17-20 часов при силе тока
0.8-1 мА на каждую трубку.
Нами был осуществлён подбор условий проведения электрофореза и подготовки материала для качественного разрешения нативных пигмент-белковых комплексов тилакоидов (табл. 2).
Тилакоиды перед обработкой детергентами ресуспендировали в среде суспендирования с добавкой 5 мМ ЭДТА, 1 мМ бензидина и 1 мМ а-аминокапроновой кислоты.
Все препараты перед нанесением на гель обрабатывали додецилмальтозидом (лаурил-Р-D-мальтозид) (ДМ). Тилакоиды обрабатывали ДМ при отношении ДМ/хлорофилл (ДМ/хл), (мг/мг), равном 10, в течение 30 с на шейкере (Vortex) непосредственно после внесения детергента, затем центрифугировали при 12000 х g, в течение 30 мин. ФС2-мембраны и ФС1-мембраны обрабатывали ДМ при отношении ДМ/хл, равном 15, в течение 20 с на шейкере. ФС2-мембраны затем осаждали в тех же условиях. Супернатанты, полученные после осаждения тилакоидов и ФС2-мембран, содержащие 50-100 мкг Хл, и ФС1-мембраны,