Диссертация на тему "Изменения состава и ферментативных активностей протеасом при апоптозе в клетках К562", скачать бесплатно автореферат по специальности 03.00.03

СОДЕРЖАНИЕ

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность проблемы.

1.2. Цели и задачи исследования

1.3. Основные положения, выносимые на защиту.

1.4. Научная новизна.

1.5. Теоретическое и практическое значение работы.

1.6. Финансовая поддержка.

1.7. Публикации.

1.8. Апробация работы.

1.9. Объем и структура диссертации

ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
2.1. Убиквнтиипротеасомнын путь деградации белков
2.1.1. Протеасо.мы
2.1.2. Ферментативные активности протеасом
2.1.3. Убиквитинзависимый протеолиз
2.1.4. Участие протеасом в важнейших клеточных процессах
2.1.5. Ингибиторы протеасом
2.2. Молекулярные механизмы регуляции апоитоза
2.3. Вовлечение убиквитинпрогеасомного пути ваиоптоз.
2 3.1. Протеасомные ингибиторы как индукторы апоитоза.
2.3.2. Ингибиторы протеасом могут также ингибировать апоптоз
2.3.3. Ингибиторы протеасом в терапии рака
ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
3.1. Культивирование клеток.
3.2. Анализ фрагментации клеточной ДНК
3.3. Флуоресцентная окраска хроматина.
3.4. Выделение препаратов цитоплазматических РНК
3.5. Выделение препаратов ндерных и цитоплазматических протеасом
3.6. Флуориметрическое измерение нротеолитическон активности протеасом
3.7. Электрофорез РНК в нативных условиях.
3.8. Электрофорез РНК в денатурирующих условиях.
3.9. Обработка протеасом щелочной фосфатазой кишечника теленка I
3 Обработка РНК с помощью протеасом.
3 Транскрипция i vi
3 Анализ содержания субъединиц протсасом и их статуса фосфорилирования метолом вестернблотинг.
3 Дискэлектрофорез белков по Лэммли
3 Двумерный электрофорез белков.
3 Латериалы
ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ.
4.1. Диэтнлмалсат и доксорубиции вызывают апоптоз в клетках К
4.2. Воздействие на клетки С2 индукторов апоптоза вызывает изменения в субъед инк ином составе цитоплазматических протсасом
4.3. Популяция протсасом в клетке гетерогенна.
4.4. После индукции апоптоза в клетках К2 субъединицы протеасом модифицируются
4.4.1. Цитоплазматические протеасомы
4.4.2. Ядсрные протеасомы.
4.5. При индукции апоптоза в клетках К2 нзменепяются ферментативные
активности протеасом
4.5.1. Воздействие на клетки К2 индукторов апоптоза изменяет специфичность протсолитическои активности протеасом
4.5.2. При индукции апоптоза в клетках К2 изменяется специфичность эпдорибонуклеазной активности протеасом
4.6. После индукции апоптоза в клетках К2 наблюдается модифицирование
субъединиц протеасом, ответственных за ферментативные активности протеасом 5, аб и
4.7. При индукции апоптоза в клетках К2 изменяется статус фосфорилирования протеасом.
4.8. Дсфосфорилирование субъединиц протеасом специфическим образом изменяет
ферментативные активности протеасом, выделенных из клегок К2.
4 8.1. Протеолитическая активность протеасом.
4.8.2. Механизм регуляции протеолитической активности протеасом при индукции апоптоза связан с фосфорилированием дефосфорилированием протеасом.
4.8.2. Эндорибонуклеазная активность протеасом.
ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ
5.1. Пхменения субъединнчного состава протеасом при апоптозе в клетках К2
5.2. Изменения ферментативных активностей протеасом при апоптозе в клетках К2.
5.3. Изменение статуса фосфорнлнрование протеасом при апоптозе в клетках К2
5.4. сспсцнфичсскос дефосфорнлированне белковых субъединиц протеасом изменяет специфичность их ферментативных активностей.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИИ
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Впервые при индукции апоптотической программы выявлены изменения статуса фосфорилирования по треонину, серину и тирозину ядерных и цитоплазматических протеасом, а также их эндорибонуклеазной активности. Наблюдается дифференциальная регуляцй РНКазной акгивности протеасом при действии индукторов апоптоза на клетки К2. Полученные результаты свидетельствуют также о существовании пока не исследованной системы регуляции статуса фосфорилирования протеасом причем различной в ядре и цитоплазме в составе программы ответа клетки на действие индукторов апоптоза. Выявлено, что при индукции апоптотической программы в клетках К2 наблюдаются модификации субъединиц Б протеасомы, в том числе каталитических, ассоциированных с протеолитической активностью трипсинподобного типа и РНКазной активностью аЗгеа и абоа. Впервые исследован механизм регуляции протеолитической и эндорибонуклеазной активностей протеасом при индукции апоптоза, а именно обнаружена зависимость исследуемых активностей ог дефосфорилирования белковых субъединиц протеасом. Полученные результаты свидетельствуют об изменениях субъединичного состава, ферментативных активностей и статуса фосфорилирования, то есть о перепрограммировании популяции цитоплазматических и ядерных протеасом при индукции апоптоза в клетках К2. Результаты работы имеют большое значение для дальнейшего углубленного изучения молекулярных механизмов, задействованных в апоптозе могут служить теоретической основой для разработки терапевтических подходов в лечении лейкемии, так как индукцию апоптоза используют для терапии рака. Протеасомы человека могут быть использованы в качестве новых фармакологических мишеней i, . Так, ингибиторы протеасом уже сейчас активно исследуются в качестве агентов противоопухолевой терапии Vi . Однако результаты экспериментов с использованием ингибиторов протеасом должны соответствовать данным по сравнительному анализу структуры и функций протеасом в норме и при патологии. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований проекты 1, 6, гранта Президента РФ по поддержке ведущих научных школ НШ, СанктПетербургского Научного Центра и годов и с использованием оборудования ЦКП Материаловедение и диагностика в передовых технологиях. По теме диссертации опубликовано печатных работ 6 статей. Петербург, , а также на Международных Конгрессах по молекулярной биологии и генетике Киев, , по внутриклеточному сигналингу Дубровник, , по биологии клетки в культуре Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия СанктПетербург, и ый конгресс Европейского биохимического общества i . Будапешт, . Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения экспериментальных данных, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 3 страницах машинописного текста, иллюстративный материал содержит рисунков. ГЛАВА 2. Первоначально деградация внутриклеточных белков представлялась довольно простым процессом, осуществляемым лизосомальными ферментами. В настоящее время общеизвестно, что основной регулируемый протеолиз в клетке осуществляется убиквитин и протеасомзависимой системой деградации белка . Протеасома представляет собой мультисубъединичный белковый комплекс, который является основным компонентом убиквитинзависимой системы деградации клеточных белков . Название протеасома, предложенное Арриго и соавторами в i . Последняя сама по себе не способна деградировать клеточные белки, однако может расщеплять некоторые короткие пептиды и развернутые белки . Протеасомы присутствуют в клетках всех организмов от архебактерий до высших эукариотических организмов, что свидетельствует об их абсолютной важности для нормальной жизнедеятельности клетки. АТФзависимый протеолитический комплекс, обладающим молекулярной массой около 2. МДа, названный протеасомой, осуществляет специфическую деградацию белков, конъюгированных с убиквитином , . Исследования строения этого комплекса методами электронной микроскопии и компьютерной томографии показали, что протеасома имеет симметричную гантелеобразную структуру i .

Название работы	Автор	Дата защиты
Изучение взаимодействия регуляторных факторов с РНК-полимеразой Escherichia coli	Нечаев, Сергей Юрьевич	2001
Идентификация инфекционных агентов, генетических детерминант патогенности и лекарственной устойчивости микроорганизмов и вирусов на биологических микрочипах	Михайлович, Владимир Михайлович	2009
Характерные особенности химерных белков RecAX21 и RecAX53(Pseudomonas aeruginosa/Escherichia coli), обладающих повышенной рекомбиногенностью	Червякова, Дарья Борисовна	2009

Электронная библиотека диссертаций

Изменения состава и ферментативных активностей протеасом при апоптозе в клетках К562