Диссертация на тему "Характеристика связывания Ku белка с Alu-повторами и их транскриптами", скачать бесплатно автореферат по специальности 03.00.25

ВВЕДЕНИЕ

Цели и задачи исследования

Основные положения, выносимые на защиту

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. История открытия семейства повторов

2. Структура повторов

3. Эволюция повторов Ю

4. Механизм ретропозиции иовторов

4.1 Транскрипция

4.2 Обратная транскрипция

4.3 Интеграция

5. РНК повторов
6. Предполагаемые функции повгоров
7. Белки, специфически взаимодействующие с ДНК повторов
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. ДНК, плазмиды, олигонуклеотиды
2. Выделение ядер и получение ядерного экстракта
3. Ионообменная хроматография белков и гельфильтрация
4. Аффинная очистка белков
5. Электрофоретическое разделение белков и их окрашивание в геле
6. Метод торможения в геле ретардация
7. Инкубация белков на нитроцеллюлозе с меченой ДНК Саузвестерн блот
8. Получение антител против бслковых комплексов
9. Иммуноблот Вестерн блот
. Непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание культуры клеток
. Иммуноэлектронная микроскопия
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Выявление белков, специфически связывающих повторы
2. Получение антител на связываюший белок р
3. Идентификация связывающего белка с молекулярной массой кДа р
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИ ТЕРАТУРЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АТ Антитела
ЬСА бычий сывороточный альбумин
ДНКПК ДНКзависимая протеинкиназа
МЭСбуфер 0.2 М 2морфолинэтансульфокислога
ОТ обратная транскриптаза
пн пара нуклеотидов
тин. тысяч пар нуклеотидов
ПААГ Полиакриламидный гель
ПЦР полимеразная цепная реакция
ЭДТА Этилендиаминтетрауксусная кислота
антитела, полученные на белковые комплексы
I iii2i, 4, 6диамидино2фенилиндол
I I i iii, флюоресцентная гибридизация i i
I Флюоресцеинизотиоцианат
I I длинные диспергированные повторы фосфатносолевой буфер
i i , фенилметансульфонилфторид I I коро ткие диспергированные повторы i , додецилсульфат натрия ПААГ полиакриламидный гель триссолсвой буфер
триссолевой буфер, содержащий 0.
ВВЕДЕНИЕ

Значительную часть некодирующей ДНК в геномах высших эукариот, до всего генома, составляют последовательности, повторяющиеся в геноме много раз. По своим структурным особенностям они были классифицированы на два главных типа повторяющихся ДНК последовательностей тандемные повторы, расположенные друг за другом, и рассеянные по геному повторы. К первым относятся микросателлиты, минисателлиты, сателлиты и теломеры, а ко вторым I I и I I . Наиболее изученным классом повторов являются теломерные повторы, представленные в большинстве эукариотов в виде тандемных повторов и в виде ретрозрансиозонов у i на концах хромосом ii, . Они необходимы для поддержания целостности хромосом в процессе репликации и являются необходимыми для жизни клеток. Роль сателлитных повторов ДНК, повидимому, заключается в структурной организации центромерных районов хромосом ii, . Функциональное значение I и I семейств повтрояющейся ДНК до сих пор остается неизвестным. В геноме человека самым многочисленным семейством повторяющейся ДНК является семейство повторов, которое относится к классу I ii, . Представителей этого семейства так много, что они встречаются практически в каждом гене, в его нитронах и нстранскрибируемых 5 и 3 областях. Около 1 ООО ООО копий повторов в клетке человека составляют примерно его генома V , . Несмотря на потрясающие успехи программы Геном человека по секвенированию всего генома, значение в организации и функционировании сю , занимаемых семейством, остается неизвестным и вряд ли будет понято в результате этой программы. Необходимы новые подходы к решению данной проблемы. ДНК по числу копий и скорости размножения в геномах приматов ii, . Это предполагает существование эффективного механизма размножения в клетке, детали которого остаются неизвестными. Помимо этого, у повторов предполагают существование, возможно, пока неизвестной функциональной нагрузки, которая позволяет быстро фиксироваться новым копиям в геноме. Концепция эгоистической ДНК , i, i, i, , к которой относили и повторы, становится все более и более неудовлетворительной в связи с накоплением новых экспериментальных данных. К настоящему моменту имеется ряд предположений о возможных функциях регуляция транскрипции близлежащих генов, организация структуры хроматина, геномные перестройки, геномный импринтинг кодируют РНК, функции которой также пока неизвестны и могут быть разнообразны ii, i , . Все эти предположения имеют косвенные экспериментальные подтверждения. Не исключено, что в будущем будут выдвинуты новые гипотезы о функции повторов в клетке. Сиквенсспецифические ДНК связывающие белки участвуют в реализации информации, закодированной в молекуле ДНК. Поэтому, можно ожидать, что изучение связывающих белков позволит приблизиться к пониманию роли самих повторов, а также процесса их размножения, включающего транскрипцию, обратную транскрипцию и интеграцию новой копии в геном. Представленная работа посвящена поиску и идентификации белков, специфически связывающих ДНК иовторов. Она является продолжением работы, начатой Перслыгиной с соавторами , показавших существование таких белков. Целью настоящей работы являлось выявление и идентификация белков нуклеоплазмы, специфически связывающих ДНК повторов человека. Выявить связывающий белок белки в нуклеоплазме. Разработать метод его частичной очистки с помощью ионнообменной хроматографии, а также метод аффинной очистки белка. Определить молекулярную массу белка белков с помощью электрофоретическог о разделения белков по Лэммли. Определить сайт связывания белка в повторе. Получить антитела на белковые комплексы и охарактеризовать их. Определить с их помощью локализацию белка в клетке. Очистить связывающий белок до состояния, близкого к гомогенности, и в количествах, достаточных для его идентификации, и идентифицировать его. Сравнить обнаруженный белок с ранее опубликованными связывающими белками. Выявлен и идентифицирован белок, специфически связывающий ДНК повторов. Им является описанный ранее Ки аутоантиген. Доказано его сайтспсцифическос взаимодействие с определенным участком в повторе. Ки белок входит в состав РНКсодержащей рибоиуклсопротеиновой частицы аРНП.

Название работы	Автор	Дата защиты
Структурная и морфометрическая характеристика яичника человека в эмбриональном и плодном периодах	Струихина, Оксана Викторовна	2006
Внутриклеточный процессинг ЭФР-рецепторных комплексов на различных стадиях клеточного цикла	Авров, Кирилл Олегович	1999
Структурная организация, экспрессия и эволюция гена, кодирующего секреторный белок ssp160 у видов рода Chironomus	Березиков, Евгений Викторович	2000

Электронная библиотека диссертаций

Характеристика связывания Ku белка с Alu-повторами и их транскриптами