Диссертация на тему "Бактериальные рибонуклеазы как индукторы дифференциальных токсических изменений клеток различного уровня организации", скачать бесплатно автореферат по специальности 03.00.07

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Биологическая активность рибонуклеаз

1.1.1. Роль рибонуклеаз в регуляции экспрессии генов.

1.1.2. Защитные функции рибонуклеаз

1.2. Цитотоксичныс рибонуклеазы различных организмов.

1.2.1. Механизмы цитотоксичности рибонуклеаз.

1.2.2. Молекулярные детерминанты цитогоксичности

рибонуклеаз.

1.3. Иммуногенные эффекты рибонуклеаз
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Используемые в экспериментальной работе материалы
2.1.1. Ферментные препараты
2.1.2. Бактериальные штаммы
2.1.3. Клеточные культуры
2.2. Методы определения токсического и генотокснческого
действия РНКаз в прокариотических тестсистемах
2.2.1. Оценка токсичности ферментных препаратов по выживаемости тестерных штаммов грамотрицательных и грам положительных микроорганизмов
2.2.2. Оценка токсичности ферментных препаратов по ингибированию уровня конститутивных ферментов
2.2.3. Тестирование на мутагенность в бактериальных тестсистемах.
2.2.3.1. Тест Эймса на выявление генных мутаций
2.2.3.2. БОБхромотест.
2.3. Оценка жизнеспособности клеточных культур.
2.4. Цитометричсскос определение апоптических клеток
2.5 Визуализация апоптических изменений клеток с помощью методов микроскопии
2.5.1. Микроскопическое исследование апоптических изменений клеточной морфологии.
2.5.2. Микроскопия с использованием витального окрашивания
флуоресцентным красителем ЛС1
2.5.3. Прямая регистрация уровня внутриклеточного Са с помощью флуорохромного агента Р1ЖА2.
2.6. Выявление двойных разрывов ДНК методом электрофореза в пульсирующем поле
2.7. Цитометрическое исследование индукции неспецифического иммунного ответа.
2.8. Статистическая обработка результатов.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Токсические и генотоксические эффекты микробных рибонуклеаз
3.1.1. Токсические эффекты рибонуклеаз
3.1.2. Индукция генных мутаций рибонуклеазами в тесте Эймса
3.1.3. ЗОБиндуцирующая активность рибонуклеаз
3.2. Апоптозиндуцирующее действие микробных рибонуклеаз на нормальные и малигннзированные клетки эукариот
3.2.1. Апоптозиндуцирующее действие рибонуклеаз на нормальные и опухолевые клетки крови
3.2.2. Апоптозиндуцирующее действие рибонуклеаз на клетки
солидных опухолей.
3.3. Оценка жизнеспособности клеточных культур при росте в присутствии микробных РНКаз.
3.4. Апоптотические изменения морфологических и физиологических характеристик клеток под действием
рибонуклеазы i ii.
3.5. Рибонуклаза i ii как индуктор поликлонального Тклеточного ответа
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Впервые показано генотоксическое действие катионных бактериальных РНКаз в тесте Эймса по индукции мутаций от ауксотрофности к прототрофности по гистидину у бактерий ii ТА 0 и в тесте по индукции ответа у ii i , при этом генотоксические свойства коррелировали с поверхностным зарядом молекулы фермента. В работе впервые с помощью методов проточной цитометрии, электрофореза в пульсирующем поле и дифференциального окрашивания зафиксировано апоптозиндуцирующее действие биназы по отношению к клеткам солидных опухолей карцинома легких А9 и клеткам миелогенного лейкоза К2 и проведен сравнительный анализ апоптогенной активности РНКазы по отношению к нормальным и опухолевым клеткам. Установлено, что в отношении нетрансформированпых аналогов опухолевых клеток фермент не проявляет апоптозиндуцирующих свойств. Впервые охарактеризован решающий вклад в апоптогенность биназы ее каталитической активности, то есть показано, что необходимым условием апоптогенности фермента является расщепление доступной клеточной РНК. Аионтические свойства катионных мутантов РНКазы 8а и биназы продемонстрированы в отношении клеточных линий нормальных и гаятрансформированных фибробластов, а также эмбриональных клеток почек человека, нормальных и искусственно экспрессирующих гены кальцийзависимых калиевых каналов, роль которых представляется важной для реализации цитотоксичности РНКаз. Впервые выявлено, что биназа, а также ее мутант ЬуэА1а с пониженной каталитической активностью не индуцировали экспрессии специфических маркеров иммунного ответа С9 и уинтерферона в популяции С и СЭ4 Тлимфоцитов, что свидетельствует об отсутствии у цитотоксичных ферментов свойств индуктора поликлонального Тклеточного ответа по типу суперантигена. Практическая значимость. Актуальность проблемы раковых заболеваний заставляет вести постоянный поиск новых препаратов и подходов для лечения злокачественных новообразований, поэтом любая возможность получения новых щадящих средств противоопухолевой терапии, избирательно поражающих злокачественные клетки, имеет несомненную практическую ценность. Настоящая работа особенно важна в связи с тем, что обосновывает индукцию бактериальными РНКазами преимущественной гибели опухолевых клеток путем апоптоза, не нарушающего функционального состояния нормальных тканей организма. В данной работе обоснована возможность получения препаратов с селективным апоптозиндуцирующим действием в отношении малигнизированных клеток на базе каталитически активных катионных микробных РНКаз. ДНКповреждающим химиотерапевтическим агентам. Установленное отсутствие у биназы свойств инициатора неспецифического иммунного ответа позволяет в первом приближении обосновать возможность использования этого фермента, а также биоинженерных конструкций на его основе в терапии опухолевых заболеваний. В ходе экспериментальной работы разработана и опробована оригинальная методика цитометрического определения апоптозиндуцирующего действия соединений, выгодно отличающаяся от классической меньшей стоимостью за счет замены использования дорогостоящих препаратов аннексина и пропидиума йодида для цитофлуорометрической фиксации апоптических изменений клеток на более дешевые аналоги мероцианин 0 и 7аминоактиномицин Э. Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа в течение гг. НИР КГУ гос. Биосинтез, биогенез, классификация, физиологические функции новых микробных ферментов и возможные области их практического применения. Исследования автора как исполнителя данной тематики поддержаны грантами Российского фонда фундаментальных исследований 5, фонда Североатлантического союза ЬБТ. СЬ0. Университеты России фундаментальные исследования ур. Республики Татарстан НИОКР АН РТ 3. Конструирование противоопухолевых препаратов селективного действия на основе микробных рибонуклсаз и Центр коллективного пользования КГУ . Развитие научного потенциала высшей школы РНП. Авторские исследования получили персональную поддержку фонда Палаты депутатов г. Берлина гг.

Название работы	Автор	Дата защиты
Биологические и технологические аспекты микробной очистки сточных вод и природных объектов от поверхностно-активных веществ и нефтепродуктов	Турковская, Ольга Викторовна	2000
Генетические и ферментные системы деструкции ароматических соединений бактерий порядка Actinomycetales	Шумкова, Екатерина Сергеевна	2009
Почвенные ацидофильные актиномицеты	Закалюкина, Юлия Владимировна	2003

Электронная библиотека диссертаций

Бактериальные рибонуклеазы как индукторы дифференциальных токсических изменений клеток различного уровня организации