Влияние изменений активности р53 и генов семейства ras на стабильность кариотипа иммортализованных и опухолевых клеток человека и грызунов

• Автор: Агапова, Лариса Степановна
• Шифр специальности: 14.00.14
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 163 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1Л. Изменения р53 в опухолевых клетках
1.2. Структурно-функциональная организация гена и белка р53
1.2.1. Ген р53
1.2.2. Функциональные домены белка р53
1.3. Физиологические функции р53 и их нарушения
в опухолевых клетках
1.3.1. Активация р53 при различных внутриклеточных изменениях
1.3.2. Роль р53 в регуляции клеточного цикла
1.3.3. Роль р53 в регуляции апоптоза
1.3.4. Роль р53 в поддержании стабильности генома
1.4. Кооперация аномалий р53 и активации онкогенов
семейства ras в канцерогенезе
1.4.1. Основные сведения об онкобелках семейства Ras
и их эффекторах
1.4.2. Изменения генов семейства ras в опухолевых клетках
1.4.3. Кооперирующее действие онкогенов ras и аномалий
р53 в экспериментальных системах in vitro
1.5. Заключение
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Клеточные линии

2.2. Получение клонов клеток LIM1215, экспрессирующих различные мутантные р53
2.3. Хромосомный анализ
2.4. Изучение распределения клеток по фазам клеточного
цикла с помощью FACScan-анализа
2.5. Изучение способности клеток входить в S-фазу клеточного цикла по включению ими 5-бромдезоксиуридина
2.6. Вестерн-анализ экспрессии р53
2.7. Определение влияния экспрессии экзогенных конструкций на частоту появления клонов клеток с потенциальной амплификацией гена cad
2.8. Анализ копийности гена cad методом гибридизации
по Саузерну
Глава 3. Результаты исследований
3.1. Влияние мутантных р53 на стабильность кариотипа
клеток LIM 1215
3.2. Влияние p53-GSE на стабильность генома крысиных эмбриональных фибробластов
3.3. Действие онкогена ras на генетическую стабильность и чекпойнты клеточного цикла в зависимости от активности р53
Г лава 4. Обсуждение полученных результатов
Выводы
Список литературы

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. Опухолевый супрессор р53 играет ключевую роль в регуляции клеточного цикла, апоптоза, репарации ДНК и некоторых других фундаментальных процессов жизнедеятельности клетки. В связи с этим неудивительно, что нарушения его функции являются наиболее универсальным изменением в различных новообразованиях человека. Согласно общепринятым представлениям, повреждения р53 ведут к инактивации охранных механизмов, предотвращающих размножение клеток, в которых уже произошли или могут произойти различные генетические изменения, в том числе и онкогенные. Так, недавно было показано, что нормальное функционирование р53 препятствует пролиферации клеток, содержащих активированные онкогены семейства ras [Serrano et al., 1997]. Вызываемая аномалиями р53 генетическая нестабильность является движущей силой неуклонной опухолевой прогрессии, детерминирующей появление и отбор все более и более агрессивных клонов. Между тем, детальные механизмы возникновения нестабильности генома при различных нарушениях р53 во многом остаются неясными. В частности, остается невыясненной роль р53 в предотвращении изменений числа хромосом. Неясны и генетические последствия кооперативного действия аномалий р53 и экспрессии активированных онкогенов семейства ras - события, которое также довольно часто наблюдается в различных новообразованиях человека.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение роли различных нарушений функции р53 и активации онкогенов семейства ras в

при активации р53, как и его роль в реализации р53-зависимого апоптоза, требуют дальнейшего уточнения.
Ряд данных позволяют предположить, что р53-зависимый апоптоз, по крайней мере в некоторых типах клеток, может быть связан и с другими, транскрипционно-независимыми, активностями р53. Так обнаружено, что в присутствии ингибитора транскрипции актиномицина D или ингибитора трансляции циклогексемида повреждения ДНК, тем не менее, индуцируют апоптоз в клетках, сохранивших аллели гена р53 дикого типа, и не вызывают гибели клеток с дефектами р53 [Caelles et al, 1994; Wagner et al, 1994]. В соответствии с этими обнаружено также, что два различных мутанта р53, утратившие транскрипционную активность (с делецией С-концевого участка и с мутациями в кодонах 22 и 23), сохраняют способность индуцировать апоптоз в клетках HeLa [Haupt et al, 1995]. Однако, тот же мутант с делецией С-концевого участка не мог индуцировать апоптоз в другом клеточном контексте, в частности в клетках линии Н1299 (карцинома легкого человека) [Sabattini et al, 1995]. Причины таких различий в реакции клеток на экспрессию транскрипционно неактивного р53 пока неясны. Вероятно, существуют и другие механизмы индукции апоптоза, осуществляемые, например, посредством белок-белковых взаимодействий. Существенный интерес здесь представляет функция SH3-связывающего пролинбогатого домена р53. Показано, что делеции в нем не влияют на трансактивационную активность р53, но значительно (примерно на 50%) ингибируют р53-зависимый апоптоз [Walker and Levine, 1996; Sakamuro et al., 1997]. Однако, механизмы регуляции апоптоза пролинбогатым доменом р53