Получение и характеристика трансгенных мышей с генами гемопоэтических факторов человека (Г-КСФ и ГМ-КСФ) под контролем 5`-регуляторной области гена α-S1-казеина козы

• Автор: Бурков, Иван Андреевич
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 152 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Достижения трансгенеза в биологии, медицине и сельском хозяйстве
1Л. 1. Создание животных, моделирующих различные наследственные заболевания человека
1Л.2. Улучшение пород существующих сельскохозяйственных животных
1Л .3. Создание трансгенных животных, служащих источником органов для пересадки человеку
1Л .4. Использование трансгенных животных в продукции ценных белков человека для нужд медицины и биологии
1.2. Методы получения трансгенных животных
1.3. Молочная железа и гены, кодирующие белки молока
1.4. Использование казеиновых генов молока в трансгенезе
1.5. Структура и функциональная значимость 5’-фланкирующих областей генов белков молока
1.6. Факторы, влияющие на экспрессию трансгена у животных
1.6.1. Эффект положения и влияние генетического окружения
1.6.2. Тип ткани-мишени, экспрессирующий трансген
1.6.3. Количество копий трансгена
1.6.4. Эпигенетические модификации трансгена
1.6.5. Эффекты присутствия гомологичных элементов в геноме
1.6.6. Структура трансгена и наличие в ней 5’-цис-действующих регуляторных элементов
1.6.7. Клеточный мозаицизм в экспрессии у трансгенных животных
1.6.8. Влияние возраста трансгенного животного и факторов окружающей среды
1.6.9. Характеристики MAR/SAR элементов и их использование в создании трансгенных конструкций
1.7. Гранулоцит-колониестимулирующий фактор (Г-КСФ)
1.7.1. Структура гена Г-КСФ
1.7.2. Регуляция экспрессии Г-КСФ
1.7.3. Биологические свойства Г-КСФ
1.7.4. Рецептор Г-КСФ
1.7.5. Клиническое применение Г-КСФ
1.8. Гранулоцит-макрофаг колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ)
1.8.1. Структура гена ГМ-КСФ
1.8.2. Регуляция экспрессии ГМ-КСФ

1.8.3. Рецептор ГМ-КСФ
1.8.4. Механизм связи лиганда с рецептором ГМ-КСФ
1.8.5. Физиологические функции ГМ-КСФ
1.8.6. Клиническое применение ГМ-КСФ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Получение трансгенных мышей
2.1.1. Подготовка рекомбинантной ДНК для микроинъекций
2.1.2. Микроинъекция и трансплантация эмбрионов
2.1.3. Анализ интеграции трансгенных конструкций и выявление трансгенных фаундеров
2.2. Анализ транскрипции генов Г-КСФ и ГМ-КСФ в органах трансгенных мышей с помощью ОТ-ПЦР
2.2.1. ОТ-ПЦР
2.2.2. Выделение РНК
2.2.3. Синтез кДНК
2.2.4. Контроль качества полученой кДНК
2.3. Определение копийности трансгена
2.4. Электрофоретический анализ ПЦР продукта
2.5. Количественное определение белков Г-КСФ и ГМ-КСФ человека в молоке и сыворотке крови трансгенных мышей
2.5.1. Получения образцов молока и сыворотки крови
2.5.2 Иммуноферментный анализ
2.6. Иммуноблоттинг белков Г-КСФ и ГМ-КСФ человека в молоке трансгенных мышей
2.6.1. Получение поликлональных кроличьих антител к ГМ-КСФ человека
2.6.2. Western Blot
2.7. Иммунофлуоресцентный анализ присутствия белков Г-КСФ и ГМ-КСФ человека в органах и тканях трансгенных мышей
2.8. Оценка биологической активности белков Г-КСФ и ГМ-КСФ человека в образцах молока трансгенных мышей
2.9. Подсчет форменных элементов периферической крови
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Изучение трансгенных мышей, с конструкцией pGoatcasGCSF
3.1.1. Создание трансгенных мышей
3.1.2. Определение количества копий трансгена pGoatcasGCSF
3.1.3. Экспрессия гена Г-КСФ человека в различных органах и тканях трансгенных мышей

3.1.4. Количественное определение содержания Г-КСФ человека в молоке и сыворотке крови трансгенных мышей с помощью иммуноферментного анализа EL1SA
3.1.5. Иммунофлуоресцентный анализ экспрессии Г-КСФ человека в молочной железе и других органах трансгенных мышей
3.1.6. Иммуноблоттинг белка Г-КСФ человека в образцах молока трансгенных мышей
3.1.7. Оценка биологической активности белка Г-КСФ человека в образцах молока трансгенных мышей83
3.1.8. Гематологический анализ лейкоцитов периферической крови трансгенных мышей
3.2. Изучение трансгенных мышей, несущих генетические конструкции pGoatcasGMCSF и pMARGoatcasGMCSF
3.2.1. Создание трансгенных мышей
3.2.2. Определение количества копий трансгенов pGoatcasGMCSF и pMARGoatcasGMCSF
3.2.3. ОТ-ПЦР анализ экспрессии трансгенов pGoatcasGMCSF и pMARGoatcasGMCSF в различных органах трансгенных мышей
3.2.4. Количественное определение содержания белка ГМ-КСФ человека в молоке и сыворотке крови трансгенных мышей с помощью иммуноферментного анализа (EL1SA)
3.2.5. Иммунофлуоресцентный анализ тканей и органов трансгенных мышей
3.2.6. Иммуноблоттинг белка ГМ-КСФ человека в образцах молока трансгенных мышей, несущих конструкцию pGoatcasGMCSF
3.2.7. Оценка биологической активности белка ГМ-КСФ человека в образцах молока трансгенных мышей с конструкциями pGoatcasGMCSF и pMARGoatcasGMCSF
3.2.8. Гематологический анализ лейкоцитов крови трансгенных мышей
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

рецепторов происходит по мере созревания клеток (Nicola and Metcalf, 1985). Рецептор Г-КСФ относится к первому типу цитокиновых рецепторов, имеет молекулярную массу 100 - 130 кДа и состоит из следующих частей: 1) консервативный домен CRH; 2) Ig-подобный и три фибронектин-3-подобных проксимальных домена на поверхности клетки; 3) трансмембранный домен; 4) внутриклеточный домен, не обладающий каталитической активностью (Larsen et al., 1990).
Связь рецептора и лиганда происходит путем контакта молекулы Г-КСФ с Ig-подобным доменом первого мономера рецептора Г-КСФ и проксимальным CRH доменом второго, в результате чего на поверхности клетки формируется особый крестообразный комплекс. Хотя рецептор Г-КСФ и функционирует как гомодимер, трехмерная структура комплекса Г-КСФ/рецептор Г-КСФ, в отличии от других комплексов гомо димерных рецепторов 1-го типа (таких, как рецептор эритропоэтина или рецептор гормона роста), обнаруживает сильное сходство с таковой для гексамерного рецепторного комплекса IL-6-a/gpl30 (Tamada et al., 2006). Более того, структурная конфигурация комплекса Г-КСФ человека/рецептор Г-КСФ человека отличается от конфигурации комплекса Г-КСФ человека/рецептор Г-КСФ мыши, но стоит отметить, что в обоих случаях клетки формируют нормальный биологический ответ. Благодаря высокой степени гомологии первичной структуры человеческого и мышиного лигандов, исследователям удалось выявить различные структуры активированного рецепторного комплекса и отметить пластичность механизмов, инициирующих реализацию сигнального пути рецептора Г-КСФ (Tamada et al., 2006)
Экспрессия рецептора Г-КСФ была обнаружена не только у гемопоэтических клеток, но и у плацентарных клеток, нейронов центральной нервной системы, эндотелиальных клеток и кардиомиоцитов (Tamada et al., 2006). В гемопоэтической системе рецептор Г-КСФ главным образом экспрессируется у клеток миелоидного ряда, в несколько меньших количествах - в моноцитах и бластных клетках. Рецептор Г-КСФ не был обнаружен у эритроцитов, лимфоцитов и эозинофилов (Nicola and Metcalf, 1985).
Активация сигнального пути рецептора Г-КСФ обеспечивается механизмом, общим для всех цитокиновых рецепторов, в работе которых задействованы