Восьмигемовые нитритредуктазы из галоалкалофильных бактерий рода Thioalkalivibrio: каталитические свойства, структура, механизм адаптации

• Автор: Тихонов, Алексей Владимирович
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 167 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИИ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ферменты цикла азота и серы у бактерий
1.1 Цикл азота
1.2. Окисление серы в микроорганизмах
2. Содовые озера
2.1 Гало алкало фшъные серуокисляющие гамма-протеобактерии
2.2 Некоторые представители рода ТЫоа1ка1тЬгю
2.3 Пространственное разнесение редокс реакций с соединениями азота
2.4. Фрагментация пути восстановления оксидов азота в условиях соленых щелочных озер
3. Восьмигемовая нитритредуктаза из галоалкалофильной бактерии ТЫоа1ка1тЬгю пИгаИгес/исеп.ч
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Реактивы, использованные в работе
2. Культивирование микроорганизмов
3. Выделение белков из культуры клеток
4. Очистка Ту№Я и ТуРаЯ
5. Электрофорез
6. Окрашивание гелей
7. Анаэробный бокс
8. Измерение активности Ту№Я и ТуРаЯ
9. Спектральные измерения
10. Кристаллизация ТуРаЯ и Ту№Я
11. Изучение диссоциации олигомеров ТуЬПЯ
12. Изучение белок-белковых взаимодействий Ту№Я с цитохромами с -возможными донорами электронов
13. Подбор праймеров и определение первичной последовательности
14. Поиск белков, гомологичных Ту№Я и ТуРаЯ
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Выделение и очистка ТуРаЯ
2. Первичная структура ТуРаЯ
3. Кристаллизация и пространственная структура ТуРаЯ

3.1. Подбор условий кристаллизации
3.2. Кристаллизация методом противодиффузии в капиллярах через границу раздела фаз, космическая кристаллизация
3.3. Пространственная структура TvPaR
3.4. Структура комплексов TvPaR
4. Спектральные свойства TvPaR
5. Каталитические свойства TvPaR; сравнение каталитических свойств TvPaR и TvNiR
5.1. Нитритредуктазная активность
5.2. Гидроксшаминредуктазная активность
5.3 Сулъфитредуктазная активность, ингибирование сульфитом
5.4. Определение константы связывания сульфит-ионов с окисленной формой TvPaR и TvNiR
5.5. Механизм ингибирования TvPaR и TvNiR ионами сульфита и нитрита
5.6. Восстановление TvPaR в присутствии сульфида
6. Олигомерное состояние TvNiR и TvPaR как фактор адаптации к экстремальным условиям функционирования
6.1. Диссоциация гексамера TvNiR под действием различных диссоциирующих агентов
6.2. Диссогршция TvNiR под действием мочевины и ГХ
6.3. Свойства олигомеров TvNiR
7. Анализ последовательностей гомологичных белков
7.7 Адаптация аминокислотного состава белков из галоалкалофилъных организмов
8. Восьмигемовые цитохром с нитритредуктазы TvNiR и TvPaR на разных стадиях роста клетки
8.1. Аэробные условия роста клеток Tv. paradoxus и Tv. nilratireducens
8.2. TvNiR в анаэробно выращенных клетках
9. Цитохромы с растворимой фракции клеточного гомогената Tv.nitratiraducens
9.1. Цитохромы с растворимой фракции гомогената Tv. nitratireducens
9.2. Взаимодействие TvNiR с другими гем с содержащими белками
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ГПИГОТС ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
Др - трансмембранный протонный градиент DMSO - диметилсульфоксид;
Kd - константа диссоциации
MES - 2-(М-морфолино)зтапсульфоновая кислота;
NED А - N-(1 -нафтил)этилендиамин дигидрохлорид;
PBS - натрий-фосфатный буфер;
PFV (protein film voltammetry) - вольтамперометрия в белковых пленках;
SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyacrylAmide Gel Electrophoresis) - электрофорез в денатурирующих условиях в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия; rmsd - среднеквадратичное отклонение;
ТМЕО - тетраметилен-оксид;
UQox/ UQred - убихинон окисленный / восстановленный;
АДФ - аденозиндифосфат;
АМФ - аденозинмонофосфат;
АТФ - аденозинтрифосфат;
ДСК - дифференциальная сканирующая мокрокалориметрия;
МК - менахинон;
МПД - 2-метилпентан-2,4-диол;
НАД(Ф) - никотинамидадениндинуклеотид(фосфат);
ПААГ - ПолиАкрилАмидный Гель;
ПЦР - полимеразная цепная реакция;
ФАД - флавинадениндинуклеотид;
ФДГ - формиатдегидрогеназа;

SoxXA - гетеродимер, образованный моно- или дигемовым цитохромом с [91,111] с массой 30.4 кДа (SoxA), тем которого имеет очень низкий потенциал (Ео' < -550mV) и моногемовым белком (SoxX) с массой 14.8 кДа и потенциалом Ео' = +161mV [91]. В зеленой бактерии Chlorobaculum tepidium SoxXA является тримером. включая в себя дополнительную субъединицу SoxK, функции которой в живой клетке пока неизвестны [112]. In vitro рекомбинантный SoxK усиливал процесс димеризации рекомбинантных SoxA и SoxX. Гомологи SoxK были обнаружены примерно в трети обследованных геномов бактерий, таких как A. vinosum и Bradyrhyzobium japonicwn [102]. SoxYZ представлен гетеродимером или гетеротетрамером, субъединицы которого, массой около 11 кДа. связаны дисульфидными мостиками и не содержат каких-либо кофакторов или ионов металлов. SoxY, один из ключевых белков комплекса, содержит уникальный мотив (V/I)KV(T/S)(V/I)GGC. который консервативен во гомологах SoxY. Предполагается, что Cys 138. расположенный на С-конце SoxY. способен ковалентно связывать серу в разных степенях окисления во время работы комплекса [92.113]. Мономерный белок SoxB. массой 50 кДа. содержит димарганцевый кластер [114] и участвует в тиогидролазной реакции, отсоединяя продукты реакции от SoxY. Sox(CD)2 - а2р2 гетеротетрамер с массой 190 кДа, субъединица SoxC (43.9 кДа) содержит молибдоптериновый кофактор, a SoxD (38.8 кДа) - два гема типа с [110].
2Н+ +
+ 2Н+

ЗН20
Рис 13. Модель окисления тиосульфата комплексом Sox. Атомы серы обозначены белыми кругами, атомы кислорода - черными. SoxAX катализирует двухэлектронное окисление при котором атом серы тиосульфата свивается с цистеином SoxY с образованием SoxY— тиоцистеии - S - сульфата [92.1 15].