Влияние 2-гидроксипропил-ß-циклодекстрина на термостабильность и агрегацию белков

• Автор: Малолеткина, Ольга Игоревна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 122 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Список сокращений
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Агрегация белков
1.2. Циклодекстршш
1.2.1. Структура и свойства циклодекстринов
1.2.2. Влияние циклодекстринов на стабильность белков
1.2.3. Влияние циклодекстринов на четвертичную структуру белков
1.2.4. Влияние циклодекстринов на агрегацию белков, сопровождающую рефолдинг
1.2.5. Влияние циклодекстринов на тепловую агрегацию белков
1.3. Креатинкиназа из мышц кролика: структура, термостабильность
1.4. Глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа из скелетных мышц кролика: структура, термостабильность
1.5. а-Кристаллин: структура, свойства и шаперонная активность
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Материалы
2.1.1. Креатинкиназа
2.1.2. Глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа
2.1.3. а-Кристаллин
2.1.4. 2-гидроксииропил-р-циклодекстрин
2.2. Методы исследования
2.2.1. рН-метрический метод определения активности креатинкиназы
2.2.2. Термоинактивация креатинкиназы
2.2.3. Определение ферментативной активности глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы
2.2.4. Термоинактивация глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы
2.2.5. Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК)
2.2.6. Определение коэффициента преломления, плотности и динамической вязкости растворов ГПЦД
2.2.7. Динамическое светорассеяние
2.2.8. Изучение кинетики тепловой агрегации белков методом динамического светорассеяния
2.2.9. УФ-облучение ГАФД

2.2.10. Электрофоретический анализ белков в ПААГ
2.2.11. Определение доли агрегированного белка
2.2.12. Аналитическое ультрацентрифугирование
2.2.13. Исследование собственной триптофановой флуоресценции белков
Глава 3. Результаты и их обсуждение
3.1. Влияние 2-гидроксипрогаш-р-циююдекстрина (ГПЦД) на тепловую инактивацию, денатурацию и агрегацию креатинкиназы из скелетных мышц кролика
3.1.1. Влияние ГПЦД на тепловую инактивацию креатинкиназы
3.1.2. Влияние ГПЦД на тепловую денатурацию креатинкиназы
3.1.3. Влияние ГПЦД на тепловую агрегацию креатинкиназы
3.1.4. Определение коэффициента преломления, плотности и динамической вязкости растворов ГПЦД (ЗО мМ Перея-КаОН, 0,1 М N301, pH 8,0; 48 °С)
3.1.5. Регистрация ассоциатов ГПЦД методом динамического светорассеяния
3.1.6. Изучение агрегации креатинкиназы при 48 °С методом динамического светорассеяния
3.1.7. Влияние а-кристаллина на тепловую агрегацию креатинкиназы
3.1.7.1. Изучение кинетики агрегации креатинкиназы при различных концентрациях а-кристаллина
3.1.7.2. Изучение кинетики агрегации при различных концентрациях креатинкиназы
3.1.8. Изучение агрегации креатинкиназы методом динамического светорассеяния в режиме сканирования по температурам
3.2. Влияние 2-гидроксипропил-Р-циклодекстршга (ГПЦД) на тепловую инактивацию, денатурацию и агрегацию глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГАФД) из скелетных мышц кролика
3.2.1. Влияние ГПЦД на кинетику термоинактивации ГАФД
3.2.2. Влияние ГПЦД на тепловую денатурацию ГАФД
3.2.3. Определение коэффициента преломления, плотности и динамической вязкости растворов ГПЦД (10 мМ Иа-фосфатный буфер, 0,1 М №С1, pH 7,5; 45 °С)
3.2.4. Влияние ГПЦД на тепловую агрегацию ГАФД
3.3. Агрегация УФ-облученной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из скелетных мышц кролика
3.3.1. Влияние УФ-облучения на ферментативную активность и термостабильность ГАФД
3.3.2. Анализ спектров триптофановой флуоресценции УФ-облученной ГАФД

3.3.3. Электрофоретический анализ УФ-облученной ГАФД
3.3.4. Седиментационный анализ УФ-облученной ГАФД
3.3.5. Определение коэффициента преломления, плотности и динамической вязкости растворов ГПЦД (50 мМ Ма-фосфатный буфер, pH 7,5; 37 °С)
3.3.6. Кинетика агрегации УФ-облученной ГАФД
3.3.7. Подавление агрегации УФ-облученной ГАФД а-кристаллином и ГПЦД
Заключение
Выводы
Список литературы

температуры проводили при помощи потенциометра, встроенного в блок управления. Истинное значение температуры воды в термостате определяли по показаниям контрольного термометра, опущенного в водяную баню.
В микроцентрифужную пробирку, помещенную в водяную баню (48 °С), вносили небольшой объем раствора фермента (30-100 мкл) с концентрацией 0,2 мг/мл и инкубировали при 48 °С в течение требуемого времени (1-400 мин). Затем раствор КФК охлаждали до 30 °С, помещая в термостат со льдом на 40 с, и измеряли остаточную ферментативную активность.
2.2.3. Определение ферментативной активности глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы
Каталитическую активность ГАФД определяли по скорости восстановления NAD+ в реакции гликолитической оксидоредукции 3-фосфоглицеринового альдегида до 1,3-бисфосфоглицериновой кислоты, регистрируя увеличение оптической плотности при 340 нм на спектрофотометре UV 1601 Schimadzu (Япония). Для определения активности были подобраны условия, которые не лимитировали каталитическую активность фермента. На моль прореагировавшего субстрата (глицеральдегид-3-фосфата) образуется 1 моль NADH. Измерения проводили в кюветах с длиной оптического пути 1 см при температуре 20 °С. Реакцию инициировали добавлением фермента в реакционную среду, содержащую 100 мМ глицин, 100 мМ NaH2PC>4, pH 8,9, 5 мМ ЭДТА, 1 мМ NAD+ и 1 мМ глицеральдегид-3-фосфат. Удельная активность ГАФД составляла 100 - 120 Е/мг белка при 25 °С.
Эксперименты по определению активности и по термоинактивации ГАФД были проведены совместно с к.б.н. Р.А. Асриянц (отдел биохимии животной клетки Научно-исследовательского института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова).
2.2.4. Термоинактивация глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы
Фермент инкубировали при 45 °С в предварительно прогретом буфере. Через определенные промежутки времени отбирали аликвоты прогретого фермента и добавляли в стандартную реакционную смесь для определения активности (конечный объем смеси составлял 1 мл).