Регуляция экзоцитоза в нейтрофилах человека

• Автор: Набокина, Светлана Михайловна
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 223 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

SNAP
SNARE
SNAP
SNAP
VAMP
FMLP

ДМСО

BoNT/A

ЭГТА
ЭДТА
ФМСФ

ДДС-Na -ПААГ -ТЕМЕД
- фактор, чувствительный к N-этилмалеимиду
- белок цитозоля, связывающийся с NSF
- рецептор для SNAP
- белок с молекулярной массой 25 кДа, ассоциированный с синаптосомами
- белок с молекулярной массой 23 кДа, ассоциированный с синаптосомами
- мембранный белок, ассоциированный с везикулами
- F-Met-Leu-Phe
- 4(3-форбол 12-миристат 13-ацетат
- диметилсульфоксид
- полимеразная цепная реакция
- рецептор
- фактор некроза опухолей
- фактор активации тромбоцитов
- ботулинический токсин серотипа А
- глутатион-5-трансфераза
- этилен-гликоль-бис-(р-аминоэтиловый эфир)-№М’-тетрауксусная кислота
- этилендиаминтетраацетат
- фенилметилсульфонилфторид
- дитиотреитол
- додецилсульфат натрия полиакриламидный гель
- П,№Щ’-тетраметилэтилендиамин бычий сывороточный альбумин

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение
I. Обзор литературы
1. Внутриклеточные гранулы нейтрофилов человека
1Л. Классификация и общая характеристика гранул
1.2. Мобилизация гранул
2. Модель слипания/слияния мембран (SNARE гипотеза)
2.1. Характеристика основных белковых компонентов модели
2.1.1. VAMP/синаптобревин
2.1.2. Синтаксин
2.1.3. SNAP
2.1.4. Синаптотагмин
2.1.5. NSF
2.1.6. SNAP
2.2. Механизм слипания/слияния мем бран
3. Особенности Са2+-триггерной стадии экзоцитоза
можная роль аннексинов
II. Материалы и методы исследований
1. Объекты исследования
2. Материалы
3. Методы
3.1 Выделение нейтрофилов человека
3.2 Субклеточное фракционирование нейтрофилов человека
3.3 Культура клеток
3.4 Электрофорез белков
3.5 Иммуноблотгинг (Вестерн-блот анализ)
3.5.1 Перенос фракций из геля на фильтр
3.5.2 Иммунное выявление антигенов на фильтре
3.6 Протеолиз SNAP-25 ботулиническим токсином BoNT/A
3.7 Активация нейтрофилов
3.8 Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия
3.9 Иммуноэлектронная микроскопия
3.10 Экстракция РНК
3.11 Синтез кДНК
3.12 Полимеразная цепная реакция
3.13 Г ель-электрофорез ДНК
3.14 Клонирование ДНК
3.14.1 Лигирование
3.14.2 Трансформация бактерий
3.14.3 Анализ рекомбинантных клонов ДНК
3.14.3.1 Выделение плазмидной ДНК
3.14.3.2 Расщепление ДНК рестриктазами (рестрикция)
3.14.3.3 Определение нуклеотидной последовательности ДНК
3.15 Получение гибридных белков GST-SNAP-23A и GST-SNAP-23B
3.15.1 Конструирование вектора для экспрессии GST-SNAP-23A/B
3.15.2 Экспрессия и очистка GST-SNAP-23A/B
3.16 Связывание белков in vitro
3.17 Получение антисыворотки
3.18 Изучение взаимодействия аннексина I с желатиназными гранулами нейтрофилов человека
III. Полученные результаты и их обсуждение
1. Белки семейства синтаксинов в нейтрофилах человека
1.1. Экспрессия синтаксинов в нейтрофилах человека
1.2. Определение первичной структуры синтаксинов 3, 4 и 6 из нейтрофилов человека

Gerst J.E., 1997; Lin R.C., Scheller R.H., 1997; Weimbs T. et al„ 1997; Naren A.P. et al., 1998). В молекуле синтаксина минимальный домен, связывающий SNAP-25, расположен между аминокислотными остатками 189 и 220 (Zhong P. et al., 1997), а сайт связывания для синаптобревина картирован между остатками 194 и 267 (Calakos N. et al., 1994). Оба перекрывающихся сайта связывания находятся в С-концевом районе молекулы синтаксина, в его так называемом НЗ домене, для которого предсказано формирование спиральной структуры. В молекуле SNAP-25 синтаксин-связывающий домен занимает N-концевую половину молекулы, включая участки пальмитоилирования (Chapman E.R. et al., 1994). Синаптобревин-связывающий домен SNAP-25 расположен в С-концевой части молекулы. Отщепление пептида, содержащего 9 аминокислот, от С-конца молекулы SNAP-25 при обработке ботулиническим токсином серотипа А, приводит к тому, что бинарный комплекс синаптобре-вин/ SNAP-25 вообще не образуется. Как и в случае синтаксина, домены SNAP-25, вовлеченные во взаимодействия с другими SNARE, содержат геп-тадные повторы аминокислотных последовательностей, характерные для определенных классов а-спиралей.
Совсем недавно в литературе появились данные двух независимых лабораторий об обнаружении минимального «корового» комплекса SNARE, устойчивого к протеолизу, и идентификации фрагментов белковых молекул, достаточных для сборки функционального тримерного комплекса (Fasshauer D. et al., 1998; Poirier M.A. et al., 1998). Минимальный «кор» включает цитоплазматический домен VAMP/синаптобревина, С-концевой фрагмент молекулы синтаксина, а также N- и С-концевые участки молекулы SNAP-25. N- и С-концевые фрагменты SNAP-25 могут функционировать как независимые домены и по отдельности связываться с VAMP и синтаксином с образованием стабильного комплекса. На основе этих данных, а также данных, полученных при помощи ЭПР, и кристаллографического анализа была предложена модель структурной организации SNARE комплекса (Poirier М.A. et al., 1998; Sutton R.B. et al., 1998). Согласно модели, SNARE комплекс состоит из четырех параллельных слоев а-спиральных участков, образованных N- и С-