Молекулярно-биологические аспекты взаимодействия ДНК и ядерного ламина D.melanogaster

• Автор: Богачев, Сергей Станиславович
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 241 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение
Глава I. Обзор литературы. Организация эукариотического ядерного хроматина в клеточном цикле
1.1. Структурно-функциональная организация митотической хромосомы
1.1.1. Модели трехмерной организации митотической хромосомы
1.1.2. Основные морфологические и функциональные домены митотической хромосомы
1.1.2.1. Хромосомный “бэндинг” и структура хроматина
1.1.2.2. Поверхностный домен
1.1.2.3. Теломерный домен. Функции теломеры
1.1.2.4. Центромерный домен
1.1.2.5. Митотическая хромосома. Формообразующие принципы
1.2. Пространственная и структурно-функциональная организация интерфазного хроматина
1.2.1. Пространственная компартментализация биохимических процессов, протекающих в клетке
1.2.2.1. Ядерный матрикс (скэффолд). Основные характеристики
1.22.2. MAR/SAR ДНК
1.2.2.3. Функции MAR/SAR
1.2.2.4. Структурные белки ядерного матрикса
1.2.3.1. Ламин и его свойства
1.2.3.2. Внутренний ядерный ламин
1.2.3.3. Функция ламина в реконструкции ядра
1.2.3.4. Ламин и репликация
1.2.3.5. ДНК-ламин взаимодействие. Уровни и возможные механизмы
Г лава II. Материалы и методы
Глава III. Собственные данные. Молекулярно-биологический анализ последовательностей ДНК Drosophila melanogaster, ассоциированных с ядерным ламином. Характер взаимодействия НК и ламина
III. 1. Характеристика последовательности ДНК из центромерного гетерохроматина D. melanogaster, связывающейся с ламином in vitro и локализующейся совместно с ядерной ламиной in situ и in vivo
III. 1.1. Клонирование последовательностей ДНК D. melanogaster, ассоциированных с CREST-антигенами
III. 1.1.1. Человеческие CREST-антитела реагируют с ядерными белками D. melanogaster
III. 1.1.2. Электронно-микроскопическая локализация белков, реагирующих с CREST-антисыворотками на митотических хромосомах D. melanogaster
III. 1.1.3. Клонирование ДНК, ассоциированной с CREST С-31-специфическими белками D. melanogaster
111.1.1.4. /и situ гибридизация клонированных ДНК с политенными хромосомами D. melanogaster
III. 1.2. Последовательности ДНК D. melanogaster, ассоциированные с ядерной ламиной
III. 1.2.1. Клонирование ДНК, ассоциированной с ядерной ламиной
III. 1.3.1. Молекулярный анализ 720р7-клонированного фрагмента ДНК
III. 1.3.2. Анализ нуклеотидной последовательности клона Dm0
III. 1.3.3. Анализ нуклеотидной последовательности клона Dm270
III. 1.3.4. In situ гибридизация 720р7-фрагмента ДНК с препаратами ядер и хромосом питающих клеток D. melanogaster
III. 1.4.1. 720р1.4 ДНК фрагмент, находящийся в составе исходного 720р7 клона, связывается с ламином D. melanogaster in vitro
III. 1.4.2. 720pi .4-фрагмент ДНК относится к умеренным повторам генома дрозофилы и представлен Hindlll - EcoRI-рестриктами длиной 1.4 и 1.6 т.п.о
III. 1.4.3. Анализ нуклеотидной последовательности 720р 1.4-фрагмента ДНК
111.1.4.4. 720р1.4 ДНК-фрагмент выделяется вместе с ДНК ядерного матрикса
D. melanogaster
III. 1.4.5. Картирование зоны связывания с ламином в структуре 720р1.4 ДНК' фрагмента
III. 1.4.6. 600 п.н. 720р 1.4 фрагмента включающих 4 тандемных повтора, взаимодействует с ламином in vitro
III. 1.4.7. In situ локализация 720pl .4 ДНК-фрагмента на политенных хромосомах D.

melanogaster
III. 1.5. Цитогенетический анализ сайтов, контактирующих с ламиной ядерной оболочки на препаратах целых политенных ядер и на препаратах политенных хромосом псевдопитающих клеток линии otul 1 D. melanogaster. Цитогенетический анализ центромерного гетерохроматина, содержащего ламин-ассоциированную ДНК
III. 1.5.1. Конфокальный анализ совместной in situ локализации 720р1.4 и ламина на препаратах политенных ядер D. melanogaster
III. 1.5.2. Локализация локусов хромосом, инвариантно контактирующих с ядерной оболочкой, в политенных ядрах трофоцитов otul 1 линии D. melanogaster
III. 1.6. Цитогенетическое и комбинированное картирование некоторых районов центромерного гетерохроматина D. melanogaster
III. 1.6.1. Картирование блоков центромерного гетерохроматина политенных хромосом otul 1 с использованием специфических ДНК-проб
III. 1.6.2. Картирование функциональной центромеры хромосомы 2 D. melanogaster 161 III. 1.7. Молекулярная организация локусов центромерного гетерохроматина хромосом дрозофилы, контактирующих с ядерной ламиной
Заключение по 1 части
III.2. Взаимодействие ламина и нуклеиновых кислот D. melanogaster in vivo. Характеристика
последовательностей ДНК генома D. melanogaster, связанных с
ламином in vivo
111.2.1. In vivo введение BrdU в геномную ДНК Кс-культуры клеток D. melanogaster
111.2.2. In vivo УФ-ковалентное кросслинкирование ДНК культуры клеток Кс*
D. melanogaster, меченых BrdU
111.2.3. Выделение НК-ламиновых комплексов с использованием специфических антител против ламина D. melanogaster
111.2.4. Анализ состава НК в НК-ламиновом комплексе
111.2.5. Ламин Dmo, экспрессированный в бактериальной системе, который первоначально был денатурирован, не связывается специфически с ДНК в ходе иммунопреципитации
111.2.6. Нуклеиновые кислоты ассоциированы с интерфазным, но не с метафазным ламином
111.2.7. Ламин ассоциирован как с А+Т -, так и G+C - богатыми областями ДНК

равномерно в интерфазном ядре, а также белки, диссоциирующие от хромосом и вновь обнаруживаемые на митотическом веретене (пассажиры хромосом). [Rattner, 1992]. Как правило, белки поверхностного домена, сочетают в себе черты разных групп, на которые они подразделяются. Тем не менее, одна из функций антигенов всех групп может состоять в предохранении хроматина митотической хромосомы от воздействия различных компонентов цитоплазмы (хроматин интерфазного ядра защищен от цитоплазматического воздействия ядерной мембраной, регулирующей белковый и ионный баланс двух клеточных компартментов). Можно предположить, что хромосомные поверхностные белки выполняют защитную функцию во время отсутствия ядерной мембраны в митозе. В настоящее время известно, что две структуры ядра вовлечены в формирование хромосомной оболочки. Это ядерная ламина - периферийный компонент ядерного матрикса и ядрышко. Сборка и разборка этих структур, по-видимому, некоторым образом связана с конденсацией и деконденсацией хромосом [Yasuda and Maul, 1990].
Белки ядрышкового организатора
Наиболее заметными структурами ядрышкового организатора являются фибриллярные образования и гранулярный компонент. Плотная фибриллярная часть ядрышка дезинтегрирует в первую очередь, и, по-видимому, является источником ядрышковых гранул и далее рибосом [для ссылок см. Jordan and Cullis, 1982; Goessens, 1984; Fakan and Hernandez-Verdun, 1986].
Данные ультраструктурного и гистохимического анализа свидетельствуют о том, что часть ядрышкового материала остается прикрепленной к хромосомам в митозе в виде рибосомальных частиц [Paweletz and Pisueno, 1982] и формирует подобие кожуха. Оказалось, что основной белок фибриллярного компонента ядрышка - фибрилларин,ассоциированный с U3 РНП, мигрирует в новую клетку, будучи прикрепленным, к поверхности хромосомы, и его поведение тесно связано с разными реорганизационными событиями ядра, такими, как разрушение и сборка ядерной мембраны, конденсации и деконденсации хромосом [Lischwe et al., 1985]. Фибриллы диссоциируют от ядрышка перед полной диссоциацией ядерной мембраны и связываются с поверхностью хромосом до разрушения ядерной оболочки. Белок связывается со всей поверхностью хромосомы за исключением центромерного района. Антиген транспортируется в новую клетку и обнаруживается в ходе восстановления ядерной оболочки на поверхности хромосом, обратной к цитоплазме. Было обнаружено, что ламин В располагается в непосредственной близи с фибрилларином на поверхности хромосом до