Выделение и изучение свойств и стабильности α-амилазы из культуры ткани Rauwolfia serpentina Benth

• Автор: Мещеряков, Никита Викторович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 105 с. : ил.

Оглавление
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Практическая значимость а-амилазы
1.2 Использование культивируемых тканей в биохимии и биотехнологии
1.3 Структура а-амилаз
1.4 Физико-химические свойства а-амилаз и специфичность их действия
" Ч ; ч . ; ?Ч >.>.' '
1.5 Механизм действия фермента
1.6 Молекулярная гетерогенность а-амилазы
1.7 Методы выделения и очистки а-амилазы
1.7.1 Осаждение органическими растворителями и высаливание нейтральными солями
1.7.2 Ионообменная хроматография
1.7.3 Аффинная хроматография
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Объекты исследования и методы культивирования
2.2 Методы получения цитозольной фракции
2.3 Методы определения активности а-амилазы

2.5 Определение концентрации белка
2.6 Выделение и очистка
2.6.1 Фракционное осаждение растворами солей
2.6.2 Г ель - хроматография
2.6.3 Аффинная хроматография
2.7 Электрофоретические методы анализа фермента
2.7.1 Электрофорез в пластинах полиакриламидного геля
2.7.2 Окраска полиакриламидных гелей для выявления белковых полос
2.7.3 Окраска геля для выявления амилолитической активности
2.7.4 Электрофорез с добавлением 8Б8
2.8 Иммунологические методы
2.8.1 Получение антисыворотки к а-амилазе
2.8.2 Радиальная иммунодиффузия в агаровом геле
2.8.3 Радиоизотопный метод определения обмена а-амилазы и общего белка
2.9 Статистическая обработка результатов
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1 Динамика уровня активности а-амилазы, содержания белка и
накопления биомассы культурой ткани Я.вегрепЬпа
3.1.1 Параметры контрольной культуры, выращенной на стандартной
питательной среде

3.1.2 Параметры культуры, выращенной на питательной среде с крахмалом
3.1.3 Исследование влияния гибберелловой кислоты на синтез и секрецию а-амилазы культурой ткани раувольфии змеиной
3.2 Определение изоферментного спектра а-амилазы из культуры ткани Rauwolfia serpentina на разные сроки культивирования
3.3 Выделение а-амилазы из культуры ткани Rauwolfia serpentina
3.3.1 Выделение а-амилазы методом гель-хроматографии
3.3.2 Получение высокоочищенной а-амилазы методом аффинной хроматографии
3.4 Влияние диметилсульфоксида на активность а-амилазы
3.5 Влияние ингибиторов на активность а-амилазы раувольфии змеиной
3.6 Изучение физико-химических свойств а-амилазы
3.6.1 Влияние температуры и pH среды на активность фермента
3.6.2 Кинетические параметры а-амилазы из культуры ткани раувольфии змеиной
3.6.3 Определение молекулярной массы изоферментов а-амилазы
3.7 Изучение кругооборота а-амилазы и общего белка в культивируемых клетках раувольфии змеиной
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

пшеничных экстрактов в одну стадию. Фермент, в данном случае, был очищен в 93 раза.
В настоящее время многочисленные работы посвящены изучению специфических ингибиторов различных амилолитических ферментов [124, 97, 89, 102]. Достигнутые в данной области успехи позволили не только разработать теорию связывания субстрата амилазами, но и получить новые аффинные матрицы для выделения этих энзимов. Высокоспецифические ингибиторы а-амилаз, связанные с сефарозами 2В, 4В, производными метакриловой кислоты позволили получить высокоочищенные амилазы из различных источников со степенями очистки 35-70 раз и выходом порядка 75% [13].