О-гликозилгидролазы морских беспозвоночных. Свойства и специфичность фукоиданаз, сульфатаз и 1→3- β-D-глюканаз

• Автор: Кусайкин, Михаил Игоревич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Владивосток
• Количество страниц: 89 с.

Благодарности. Выражаю искреннюю благодарность моим научным руководителям доктору химических наук Татьяне Николаевне Звягинцевой и кандидату химических наук Виктории Васильевне Сова за неоценимую помощь на всех этапах выполнения и написания данной работы.
Я признателен также к.х.н. И.Ю. Бакуниной, к.х.н. Н.М. Шевченко, к.х.н. С.Г1. Ермаковой, к.х.н. Е.В. Сундуковой и другим сотрудникам лаборатории химии ферментов за участие в исследовании и заинтересованное отношение к работе.
Не в меньшей степени я благодарен директору ТИБОХ ДВО РАН академику В.А. Стонику и сотрудникам ТИБОХ ДВО РАН: чл.-к. В.Е. Васьковскому, к.б.н. И.А. Горшковой, д.х.н. Т.Н. Макарьевой, д.х.н С.А. Авилову, д.б.н. В.И. Калинину. В.А. Бабко, к.х.н. Е.Л. Назаренко, к.х.н. В.В. Исакову за помощь на отдельных этапах работы, а также сотруднику ИОХ им. Н.Д. Зелинского РАН - к.х.н. А.О. Чижову.
СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Структурная организация ферментов. Классификация о-гликозилгидролаз, основанная на сходстве первичной последовательности
1.1.1. Каталитические домены различных семейств и особенности их укладки
1.1.2. Молекулярный механизм действия О-гликозилгидролаз
1.1.3. Эволюционные аспекты
1.1.4. Углевод-связывающие модули и их классификация.
1.1.5. Линкеры
1.2. ФУКОИДАНЫ
1.3. ФУКОИДАНАЗЫ (ФУКОИДАН ГИДРОЛАЗЫ)
1.3.1. Распространение фукоиданаз
1.3.2. Выделение и очистка фукоиданаз
1.3.3. Сведения о свойствах фукоиданаз
1.4. СУЛЬФАТАЗЫ
1.5. 1—>3-Р-0-ГЛЮКАНАЗЫ (ЛАМИНАРИНАЗЫ) ИЗ МОРСКИХ ИСТОЧНИКОВ.
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Распространение некоторых О-гликозилгидролаз в морских беспозвоночных
3.2. Выделение и характеристика О-гликозилгидролаз морского брюхоногого моллюска ИНогта кигИа
3.2.1. Фукоиданаза
3.2.1.1. Выделение и физико-химические свойства
3.2.1.2. Специфичность действия фукоиданаз
3.2.1.3. Функциональные группы фукоиданаз, участвующие в трансформации субстрата
3.2.2. а-Ь-Фукозидаза
3.2.3. Сульфатаза
3.2.4. Изучение свойств и специфичности 1—+3-Р-0-глюканаз
3.2.4.1. 1—>3-Р-0-Глюканаза из гепатопанкреаса Ииог 'та кигПа
3.2.4.1.1. Физико-химические свойства
3.2.4.2. 1—>3-Р-0-Глюканаза из неоплодотворенных яйцеклеток морского ежа 51гопяу1осетго1из 1п1егтесИи$'
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
БСА - бычий сывороточный амльбумин ВМФ - высокомолекулярная фракция КД - каталитический домен
ЛО - 1—»З-Р-И-глюканаза из кристаллического стебелька Chlamys albidus Jill - 1->3-Р-0-глюканаза из Eulota maakii
ЛГУ - 1-»3-р-0-глюканаза из кристаллического стебелька Spisula sachalinensis
Ле - 1->3-р-0-глюкаиаза из неоплодотворенных яйцеклеток Strongylocentrotus intermedius
НМФ - низкомолекулярная фракция
ТФУ>~ трифторуксусная кислота
УСМ - углсвод-связывающий модуль
CAZy - Carbohydrate-active enzymes
DMSO - диметилсульфоксид
EC - Enzyme committee
Km - константа Михаэлиса
Mel - йодистый метил
Mr - молекулярная масса
п - степень полимеризации
p-Np - сульфат - н-нитрофенил-сульфат
p-Np-Fuc - л-нитрофснил-а-Е-фукопиранозид
p-Np -Gal - л-нитрофенил-р-О-галактопиранозид
p-Np -Glc - л-нитрофенил-р-О-глюкопиранозид
p-Np -Mail - «-нитрофенил-а-И-маннопиранозид
TMS - тетраметилсилан

полисахарид из стенок яиц морского ежа, а также фукан сульфат с трудом подвергались действию фермента. Медленное отщепление сульфатных групп от хондроитин сульфата и декстран сульфата может быть обусловлено присутствием хондроитинсульфатазы в ферментном препарате.
Ранее было показано (Thanassi et al., 1967), что в гепатопанкреасе морского моллюска Haliotus sp. присутствовала арилсульфатаза, гидролизующая и-Np-сульфат. Частично очищенный препарат фукоиданазы из этого же источника обладал слабой сульфатазной активностью относительно фукоидана и сульфатированных олигосахаридов, но не действовал на «-Np-сульфат. Авторы предполагают, что десульфатирование не предшествует действию фукоиданазы. Сульфатаза, по их мнению, действует уже на низкомолекулярные компоненты: сульфатированные фукозу и фукоолигосахариды.
Имеются сведения о сульфатазах, которые катализируют отщепление сульфатных групп от полимерного субстрата. Недавно французскими исследователями была выделена и частично очищена сульфоэстераза из двустворчатого моллюска P. maximus (Daniel et al., 2001). Препарат сульфоэстеразы, содержащий различные гидролазы и гликозидазы, эффективно гидролизовал синтетический субстрат - и-нитрокатехол-сульфат. Была также проверена способность сульфоэстеразы отщеплять сульфатные группы от изомеров сульфатированной L-фукозы. Исследование показало, что сульфоэстераза высокоспецифична к изомеру L-фукозы, сульфатированному по положению 2. Этот же препарат действовал и на природный фукоидан с молекулярной массой около 13 кДа и содержанием сульфатов 34% от массы. В процессе реакции десульфатирования фукоидана высвобождалось около 10% сульфатов.
Анализ данных о специфичности сульфатаз позволяет заключить, что ферменты, катализирующие расщепление «-нитрофенил-сульфата часто, катализируют расщепление и других субстратов. Поэтому классификация ферментов, обладающих широкой субстратной специфичностью, вызывает определенные трудности. В связи с этим на первый план выходит классификация ферментов, основанная на сходстве структур молекул ферментов. Сульфатазы, выделенные из эукариот и прокариот, содержат в активном центре а-формилглицин (FGly). FGly в молекуле фермента появляется в результате пост-трансляционной модификации аминокислот - Cys - у эукариот, Ser - у прокариот.