Рибосомные белки S13 и S16 человека : влияние на сплайсинг собственных пре-мРНК

• Автор: Парахневич, Наталья Михайловна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 120 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
ВВЕДЕНИЕ
ГJIABA 1. Регуляция экспрессии генов на уровне сплайсинга (Обзор литературы)
1.1. Регуляция сплайсинга пре-мРНК белков, участвующих в метаболизме РНК
1.1.1. Регуляция сплайсинга пре-мРНК SR-белков
1.1.1.1. Регуляция сплайсинга пре-мРНК белка SRp20
1.1.1.2. Регуляция сплайсинга пре-мРНК белка SC35
1.1.1.3. Регуляция сплайсинга пре-мРНК белка 9G8
1.1.1.4. Регуляция сплайсинга пре-мРНК белка tra
1.1.1.5. Регуляция сплайсинга пре-мРНК белка tra2-betal
1.1.1.6. Регуляция сплайсинга пре-мРНК белка atRSZ33
1.1.1.7. Регуляция сплайсинга пре-.мРПК белка RSZ36
1.1.2. Регуляция сплайсинга пре-мРНК белков hnRNP
1.1.2.1. Регуляция сплайсинга пре-мРНК белка РТВ
1.1.2.2. Регуляция сплайсинга пре-мРНК hnRNP Al
1.1.2.3. Регуляция сплайсинга пре-мРПК белка HRP59
1.1.3. Регуляция сплайсинга пре-мРНК других белков
1.1.3.1. Регуляция сплайсинга пре-мРНК белка Yralp
1.1.3.2. Регуляция сплайсинга пре-мРНК Nova
1.1.3.3. Регуляция сплайсинга пре-мРНК SWAP
1.1.3.4. Регуляция сштайашга пре-мРНК белков Т1А-1 и TIAR
1.1.3.5. Регуляция сплайсинга пре-мРНК Sex-lethal
1.2. Участие рнбосомных белков в регуляции сплайсинга своих пре-мРНК
1.2.1. Регуляция сплайсинга пре-мРНК rpL30
1.2.2. Регуляция сплайсинга пре-мРНК rpS14
1.2.3. Регуляция сплайсинга пре-мРНК rpLl
1.2.4. Регуляция сплайсинга пре-мРНК rpL12
1.2.5. Регуляция сплайсинга пре-мРНК rpS28
1.2.6. Регуляг/ия сплайсинга пре-мРНК rpL3
1.2.7. Регуляция сплайсинга пре-мРНК rpS26
1.3. Заключение
Г ЛАВА 2. Экспериментальная часть
2.1. Материалы
2.2. Выделение 40S субчастиц рибосом человека
2.3. Выделение суммарного 40S рибосомного белка
2.4. Анализ рнбосомных белков гель-электрофорезом
2.5. Получение рекомбинантных рнбосомных белков S13 и S16 человека
2.6. Ренатурация рекомбинантных рнбосомных белков S13 и S16 человека и регистрация КД-
спектров

2.7. Иммуноблотинг
2.8. Выделение антител против рибосомного белка S13
2.9. Получение ДНК-матриц для синтеза фрагментов мРНК и пре-мРНК рибосомных белков S13 и
S16 человека
2.10. Получение РНК-транскриитов
2.11. Получение [32Р]-геченьтх олигодезоксирибонуклеотидов
2.12. Связывание рибосомных белков с РНК-транскршггами и определение кажуиигхся констант
ассоциации
2.13. Связывание белка S13 с различными фрагментами пре-мРНК в составе ядерного экстракта
клеток HeLa
2.14. Ферментативный футпринтинг
2.15. Сплайсинг фрагментов пре-мРНК S13 и S16 in vitro и анализ продуктов сплайсинга
2.16. Трансфекция клеток НЕК 293 плазмидными конструкциями и ПЦР в реальном времени
2.17. Анализ первичной и вторичной структуры белков и РНК
Г ЛАВА 3. Рнбосомные белки S13 и S16 человека: влияние на сплайсинг собственных пре-мРНК
3.1. Получение и характеризация рекомбинантных рибосомных белков S13 и S16
3.1.1. Создание штаимов-суперпродуцентов рекомбинантных рибосомных белков S13 ч S16
человека
3.1.2. Синтез рекомбинантных рибосомных белков S13 и S16, их очистка и рефолдинг
3.2. Влияние рибосомных белков S13 и S16 на сплайсинг собственных пре-мРНК
3.2.1. Анализ степени идентичности нуклеотидных последовательностей генов рибосомных белков
S13 и S16 млекопитающих
3.2.2. Связывание рекомбинантных рибосомных белков S13 и S16 с фрагментами собственных
пре-мРНК и мРНК
3.2.3. Связывание rpS13 с фрагментом своей пре-мРНК в составе ядерного экстракта клеток HeLa
3.2.4. Влияние рибосомных бачков S13 и S16 на сплайсинг фрагментов собственных пре-мРНК in
vitro
3.2.5. Ферментативный футпринтинг фрагмента пре-мРНК rpS13 в комплексе с rpS13
3.2.6. Влияние rpSI3 на сплайсинг фрагмента его пре-мРНК, несущего мутации вблизи сайтов
сплайсинга
3.2.6. Влияние rpS13 на сплайсинг фрагмента его пре-мРНК, несущего мутации вблизи сайтов
сплайсинга
3.2.7. Ингибирование белком S13 сплайсинга своей пре-мРНК iv vivo
3.2.8. Предлагаемый механизм, по которому происходит регуляция сплайсинга пре-мРНК
рибосомных белков SI3 1/S16
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
ATP, GTP (ГТФ) и т.д. - общепринятые обозначения 5’-трифосфатов нуклеозидов
DEPC - диэтилпирокарбонат
DTT — 1,4-дитио-0,Ь-треитол
EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота
ENU — N-этил-М-нитрозомочевина
EST - маркеры экспрессирующихся последовательностей (от англ. expression sequence taqs)
HEPES - Ы-2-гидроксиэтилпипераз1ш-М’-2-этансульфоповая кислота
hnRNP — гетерогенный ядерный рибонуклеопротеиновый белок
IRES - участок внутренней посадки рибосомы (от англ. internal ribosome entry site)
Ka - кажущаяся константа ассоциации НАс - уксусная кислота NaAc - ацетат натрия
NMD - деградация бессмысленных РНК (от англ. nonsense mediated decay)
rpS и rpL - рибосомный белок (от англ. ribosomal protein) малой и большой рибосомной
субчастицы соответственно
SDS - додецилсульфат натрия
SELEX — метод систематического отбора лигандов путем экспоненциального обогащения (от англ. Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment)
БСА - бычий сывороточный альбумин ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ИПТГ - изопропил-Р-Н-тиогалактознд
ИХБФМ СО РАН - Институт химической биологии и фундаментальной медицины
Сибирского отделения Российской академии наук
КД - круговой дихроизм
кДНК — комплементарная ДНК
крио-ЭМ - криоэлектронная микроскопия
миРНК — малая интерферирующая РНК
мРНК - матричная PIIK

важной роли фрагмента СА у интрона пре-мРНК грЬЗО в ингибировании сплайсинга этой пре-мРНК, которое было подтверждено с помощью направленного мутагенеза. Так показано, что при замене СА на АТГ эффект ингибирования сплайсинга пре-мРНК грБЗО кодируемым белком полностью исчезает, что авторы объяснили нарушением вторичной структуры в районе 5’-сайта сплайсинга за счет отсутствия комплементарных взаимодействий между нуклеотидами в положениях 6 и 64 (см. рис. 16А). В последующих опытах при замене вб на и ингибирования сплайсинга также не наблюдали, а при замене пары С6*С64 на иб*А64, не нарушающей вторичной структуры упомянутого участка, сплайсинг мутантной пре-мРНК проходил аналогично сплайсингу пре-мРНК, не содержащей замен. Аналогичные результаты получены и для других нуклеотидных остатков, вовлеченных в формирование предложенной вторичной структуры, из чего авторы [127] сделали вывод, что специфичность связывания грЬЗО с кодирующей его пре-мРНК определяет не только нуклеотидная последовательность, но и вторичная структура сайта связывания.
Рис. 16. Вторичная структура участков пре-мРНК (А) и мРНК (Б) грЬЗО, вовлеченных в регуляцию сплайсинга и трансляции соответственно [127, 129].
Регуляция сплайсинга пре-мРНК грЬЗО кодируемым белком является эволюционно консервативной и реализуется в других видах дрожжей. Так, показано, что грЬЗО К1иучеготусеь 1асШ также способен ингибировать сплайсинг кодирующей его пре-мРНК, а нуклеотидная последовательность, соответствующая его участку связывания на пре-мРНК, идентична нуклеотидной последовательности участка связывания грЬЗО 5. сегешз1ае на его пре-мРНК [127].
Поскольку в образование вторичной структуры регуляторного участка, как оказалось, вовлечена также последовательность первого экзона, то авторы [129] предположили, что

экзон 11 экзон