Дизайн системы векторов для экспрессии каталитических антител

• Автор: Демин, Александр Викторович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 107 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1Л. Экспрессия антител
1ЛЛ. Рекомбинантные антитела
1Л.2.Экспрессия антител в Escherichia coli
1Л.З. Экспрессия атител в дрожжах
1.1.4. Экспрессия антител в клетках насекомых
1.1.5. Экспрессия антител в клетках млекопитающих
1.2. Каталитические антитела
1.2.1. Гидролитические антитела, полученные иммунизацией аналогами переходных состояний
1.2.2. Природные каталитические антитела
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Материалы
2.2. Методы
2.2.1. Конструирование векторов
2.2.2. Экспрессия фрагментов антител
2.2.3. Получение периплазматического экстракта
2.2.4. Очистка экспрессированного продукта
2.2.5. Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле и окрашивание полиакриламидных гелей
2.2.6. Иммуноблот

2.2.7. Реакция релаксации суперскрученной плазмидной ДНК
2.2.8. Выделение плазмидной ДНК
2.2.9. Электрофорез в агарозном геле
2.2.10. Анализ ассоциированности ДНК-гидролизующей
активности с антителами методом аффинной сорбции
2.2.11. Определение активности Fab фрагмента антитела 1F5
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Разработка системы экспрессии для протеолитической легкой цепи
3.2. Клонирование эстеролитического антитела 1F5
3.3. Экспрессия Fab-фрагмента эстеролитического антитела 1F5
3.4. Моделирование Fab-фрагмента и анализ вероятного
активного центра эстеролитического антитела 1F5
3.5. Моделирование Fab-фрагмента и анализ вероятного активного центра ДНК-связывающего антитела MRL4. Экспрессия Fab-фрагмента ДНК-связывающего антитела MRL4
ГЛАВА 4. ВЫВОДЫ
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

ВВЕДЕНИЕ
За последнее десятилетие представления об антителах претерпели значительные изменения. Обнаружены новые свойства этих белков: способность катализировать химические превращения, цитотоксичность, способность проникать в клетку. Особое внимание уделяется исследованиям каталитических свойств антител, изучение которых интересно как с точки зрения решения фундаментальных проблем биокатализа - детализации механизмов катализа самых разнообразных реакций, так и для прикладных разработок, направленных на создание новых устойчивых биокатализаторов.
Естественно, что детальное изучение действия каталитического антитела, как и любого фермента, невозможно без клонирования его гена, мутагенеза и анализа мутантных форм. Самым распространенным на сегодняшний день методом получения продуцентов антител является гибридомная техника. Но давая возможность получать каталитические антитела, она не позволяет производить направленный мутагенез абзимов. Поэтому естественным продолжением развития этой области стало получение рекомбинантных антител в бактериальных и эукариотических культурах клеток.
Самой распространенной и развитой на сегодняшний день системой экспрессии антител является система клонирования и экспрессии одноцепочечных антител на основе вектора рСЛМТЛВ. Но применение одноцепочечных антител имеет много недостатков, одним из которых является возможность потери каталитической активности при переходе от интактного антитела к одноцепочечному. По этой причине актуальным является сохранение нативной структуры антиген-связывающего фрагмента при любых операциях с

раскрывания эпокси- кольца, но также преодолевает энтропийный барьер и имеет структуру, обеспечивающую геометрию гидроксильной группы, благоприятствующую замыкания шестичленного кольца. Кроме того, для преодоления проблемы ингибирования реакции ее продуктом необходимо, чтобы структура связывающего центра антитела препятствовала связыванию итогового продукта. Гаптен, использованный для иммунизации, был создан таким образом, чтобы связывающий центр индуцированного им антитела стабилизировал частичный заряд при реакции разрыва С-0 связи, содержал структурную информацию, способствующую образованию шестичленного кольца, а разница в заряде между гаптеном и продуктом препятствовала ингибированию реакции продуктом. Действительно, полученное в результате такой иммунизации антитело катализировало образование исключительно шестичленного кольца. В качестве другого примера катализа неблагоприятного с энергетической точки зрения процесса можно рассмотреть превращение енолового эфира. В воде эта реакция идет исключительно с образованием кетона. Антитело 1409, полученное на гаптен, содержащий в своей структуре четвертичный аммонийный катион, оказалось способным катализировать образование кеталя в соотношении, которое в обычном случае достигается только в 97% диоксане, но в 10 миллионов раз быстрее [139]. Таким образом, антитело в своем связывающем центре эффективно предохраняло субстрат от контакта с водой. Это же антитело было в дальнейшем использовано для катализа первой (стереоселективной) стадии синтеза биологически активного (-)-а-мультистрианина в препаративных количествах [140]. Антитело катализировало превращение енолового эфира в асимметричный кетон с ускорением в 65000 раз и с 95% выходом целевого продукта. Обычный химический синтез не может обеспечить стереоселективного