Изучение эволюционно-вариабельных участков β '-субъединиц бактериальных РНК-полимераз

• Автор: Захарова, Наталья Александровна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 123 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1 Л. Общие сведения о структуре РНК-полимеразы E. coli и стадиях
транскрипционного цикла
1.2.а-субъединица РНК-полимеразы E
1.3. ß-субъединица РНК-полимеразы E
1.4. ß'-субъединица РНК-полимеразы E
1.5. a-70-субъединица РНК-полимеразы E
1.6. Заключение
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Бактериальные штаммы
2.2. Источники препаратов геномной ДНК
2.3. Плазмиды
2.4. Питательные среды и условия выращивания бактерий
2.5. Компетентные клетки и трансформация бактерий
2.6. Выделение плазмидной и геномной ДНК
2.7. Использование ферментов в молекулярном клонировании
2.8. Денатурирующий электрофорез ДНК и выделение фрагментов ДНК из гелей
2.9. Денатурирующий электрофорез РНК
2.10. Денатурирующий электрофорез белков
2.11. Олигонуклеотиды и определение первичных последовательностей ДНК
2.12. Цепная полимеразная реакция (ЦПР)
2.13. Делеционный мутагенез гена гроС
2.14. Сборка РНК-полимеразы из отдельных субъединиц
2.15. Выделение РНК-полимеразы Н. pylori
2.16. Определение аминокислотной последовательности белка
2.17. Моноклональные антитела и иммуноблоттинг
2.18. Реакция транскрипции in vitro
2.19. Реакция абортивной инициации
2.20. Аффинное мечение РНК-полимеразы
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Изучение СООН-концевого эволюционно-вариабельного
района р'-субъединицы РНК-полимеразы Е
3.1.1. Получение делеций в вариабельном районе гена гроС Е. coli и картирование антигенной детерминанты моноклональных антител
3.1.2. Свойства гроС-мутантов in vivo
3.1.3. Сборка мутантных РНК-полимераз in vitro
3.1.4. Транскрипционная активность мутантных РНК-полимераз
3.1.5. Расщепление PIIK-продукта в тройных элонгационных
комплексах мутантными ферментами
3.1.6. Влияние связывания антител с РНК-полимеразой на
реакцию транскрипции in vitro
3.2. Исследование структурной организации генов гроВ/С
s-группы протеобактерий
3.2.1. Филогенетический анализ участков стыковки генов гроВ и гроС из
е-группы протеобактерий
3.2.2. Выделение РНК-полимеразы Я. pylori
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА

в положениях 1_ут1065 и Шз1237 в |3-субъединице. Поскольку эффективная длина реакционной группы составляла не более 3 ангстрем, можно утверждать, что аминокислотные остатки ЬувЮбб и Н 1237 сближены в третичной структуре РНК-полимеразы, и находятся вблизи района связывания первого субстрата. Однако, следует отметить, что замены аминокислотных остатков в положениях 1065 и 1237 (К1065К, Н1237А) не повлияли на каталитическую функцию фермента, но ингибировали переход из стадии инициации в стадию элонгации транскрипции.
Северинов и соавторы воспользовались аналогичным методом картирования районов химических сшивок аналога первого субстрата (Беуеппоу Щ а1., 1995, А). В их экспериментах использовался аналог первого субстрата, модифицированный по 5'-концу алкилирующей группой широкого спектра действия, которая имела эффективную реакционную длину 5 ангстрем. Район, с которым взаимодействовал данный аналог первого субстрата, был локализован в р-субъединице между аминокислотными остатками Уа1516 и Аге540. Этот район (ШР-кластер I), как упоминалось выше, содержит большое количество мутаций устойчивости к рифампицину. Таким образом, в данной работе было обнаружено, что Яй-кластер I находится в непосредственной близости от выхода 5-конца РНК-продукта из активного центра, что ещё раз подтверждает предположение, что механизм ингибирования транскрипции рифампицином связан с влиянием антибиотика на активный центр РНК-полимеразы.
Логическим продолжением двух вышеупомянутых исследований, в которых использовались химически-модифицированные субстраты, является работа Марковцова, из лаборатории Гольдфарба, в которой автор исследовал районы