Структурные особенности промоторной ДНК и их роль в активации транскрипции

• Автор: Масулис, Ирина Станиславовна
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 125 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
1. Введение
2. Обзор литературы
2.1. Общие представления о механизмах инициации транскрипции
2.1.1. Предварительная характеристика РНК-полимеразы и промоторных участков ДНК - основных партнеров в инициации транскрипции
2.1.2. Кинетическое описание процесса инициации транскрипции
2.2 Структура РНК-полимераза-промоторных комплексов: методология исследования и современные представления.
2.2.1. Методы непосредственной регистрации транскрипционных комплексов
2.2.2. Картирование полимераза-промоторного взаимодействия
2.2.3. Структура открытых полимераза-промоторных комплексов
2.2.4. Представления о динамике полимераза-промоторного взаимодействия (по материалам структурных исследований)
2.2.5. Функциональная топология РНК-полимеразы
2.3. Конформационный полиморфизм ДНК и его роль в регуляции транскрипции
2.3.1. Искривление оси двойной спирали: изгибы и кинки.
Структурная основа
2.3.2. Изгибные свойства ДНК и активация транскрипции
2.3.3. Структурные образования с отличной от В-формы конформацией. Генезис и предполагаемая роль
2.4. Заключение

3. Материалы и методы исследования
4. Результаты и их обсуяедение
4.1. Температурная зависимость скорости абортивного синтеза РНК для комплекса РНК полимеразы E.coli с промотором T7D
4.2. Характеристика РНК полимераза-промоторных комплексов методом “задержки в геле”
4.3. Температурная зависимость структурных особенностей ДНК промотора T7D: анализ миграции в нативном ПААТ
4.4. Энзиматическое тестирование структуры промоторной ДНК
4.5. Анализ структуры полимераза-промоторных комплексов методом футпринтинга ДНКазой
4.6. Локализация структурных деформаций в РНК полимераза-промоторных комплексах методом футпринтинга перманганатом калия
4.7. Заключение
Выводы
Список цитированной литературы

ВВЕДЕНИЕ
Исследование механизмов регуляции генетической активности, лежащих в основе развития и сбалансированного функционирования клетки и организма в целом, является одной из фундаментальных проблем биологической науки. Первой ступенью в воспроизведении наследственной информации как у про-, так и у эукариот является ДНК-зависимый синтез РНК, контролируемый в клетке на всех стадиях транскрипции. Однако наиболее эффективные механизмы, определяющие выбор экспрессируемого гена в зависимости от метаболического статуса и адаптационных потребностей клетки, действуют на этапе инициации синтеза РНК. Этот процесс предполагает специфическое взаимодействие фермента транскрипции - ДНК-зависимой РНК-полимеразы с промоторными участками ДНК, включает несколько стадий и завершается образованием транскрип-ционно активного комплекса. На стадии инициации синтеза РНК реализуется действие большинства факторов белковой и небелковой природы, модулирующих эффективность транскрипции. Основные молекулярные механизмы реализации генетической информации обнаруживают высокую степень эволюционной консервации как у про-, так и у эукариот (гомология функциональных доменов фермента; наличие консервативных промоторных детерминант; параллелизм основных стадий инициации). Этим в значительной степени обусловлен интерес исследователей к организации транскрипционного аппарата Е.соИ, который можно рассматривать как адекватную модель базовых механизмов экспрессии генетической информации.
Несмотря на многолетний устойчивый интерес к исследованию процесса инициации синтеза РНК у бактерий и значительный

фоне преобладания стабильного RPC2- Транскрипционно активный комплекс RP02, преобладающий при 37°С, характеризуется пролонгированием расплавленного участка, по крайней мере, до положения +2. В силу гетерогенности популяции комплексов в низкотемпературной области представляется неправомерным поиск прямых корреляций нуклеации локального плавления и развития полимераза-промоторных контактов для конкретного “температурного среза”.
О значимости отдельных промоторных элементов для этого процесса можно судить на основании данных мутационного анализа промоторов. Так, для промотора galPl показано, что делеция области выше положения -49, замены в положениях -45—48 и делеции 9-го и 14-го нуклеотидов в кодирующей части вблизи стартовой точки транскрипции не влияют на характер нуклеации плавления в области -11—5 при 12°С. В то же время последовательность -45—35 промотора galPl определяет характер плавления гибридного промотора galPl-cysG, понижая температуру транзиции с 25 °С (определенной для cysG по реактивности -11Т к KMnO/j) до 12°С. Мутация в -10 области, приближающая ее к консенсусу - TATGGT-TTATAAT, существенно облегчает первичное плавление в —11. При всей значимости динуклеотида TG (-15,-14) для активации промоторов galPl и cysG его присутствие не является существенным для нуклеации “transcription bubble” (Bums et al., І996). Взаимодействие в “downstream” области также не является абсолютно необходимым условием для первичного плавления в —10. Так, мутантная РНК полимераза с делецией в N-концевой области Р-субъединицы (А 186-433) взаимодействует с участком промотора —40—+1 в температурном диапазоне -20~+37°С, вызывая нуклеацию плавления в -15—9 — регистрируется комплекс, зафиксированный на стадии RP0i (показано для промоторов Т7А2, Т7А1, deoPl, galPl) ( Severinov&Darst, 1997). Суперспирализация не стимулирует образование характерного RP02 с контактами в кодирующей части и пролонгированным расплавленным участком. Лишь в присутствии инициирующих субстратов при 37°С формирутся RP02, аналогичный комплексу с ферментом дикого типа. Таким образом, область, ответственную за первичное плавление можно ограничить отрезком промотора -40-+1 с приоритетным значением -10 консенсусного гексамера.