Роль локуса flamenco и генов hp1 в регуляции транспозиции ретротранспозонов группы gypsy y Drosophila melanogaster

• Автор: Лавренов, Антон Русланович
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 101 с. : ил.

Оглавление
Список сокращений
ЕМОБИЛЬНЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭЛЕМЕНТЫ И МЕХАНИЗМЫ
КОНТРОЛЯ ИХ ТРАНСПОЗИЦИИ (обзор литературы)
1.1 .Классификация МГЭ
1.2.Структура и механизм транспозиции ДКП ретротранспозонов
1.3.Механизмы регуляции транспозиции ретроэлементов
ГЗЛ.РНК-интерференция
1.3.1.1.Пути РНК-интерференции, связанные с siPHK и miPHK
1.3.1.2.Путь РНК-интерференции, связанный с piPHK
1.3.2.Регуляция посредством участия белков семейства НР
П.МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
П.ЕМатериалы
II. 1.1.Линии D. melanogaster и их характеристики
И. 1.2.Штаммы Escherichia coli
II. 1.3.Векторы
П.2.Методы
II.2.1.Приготовление компетентных клеток E. coli
П.2.2.Трансформация E. coli
И.2.3.Выделение хромосомной ДНК
II.2.4.Выделение плазмидной ДНК из клеток E.coli
П.2.5.Сбор тканей для последующего выделения РНК
II.2.6.Выделение тотальной РНК
Н.2.7.0бработка ДНКазой
Н.2.8.0братная транскрипция
П.2.9.Полимеразная цепная реакция
П.2.10.Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени
II.2.11 .Клонирование в плазмидах и получение векторных конструкций,
содержащих регуляторные области ретротранспозонов
Н.2.12.Электрофорез в агарозном геле
Н.2.13.Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля
11.2.14.Секвенировани е
11.2.15.Получение рекомбинантных белков
II.2.16.Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии

II.2.17.Окраска полиакриламидных гелей красителем Coomassie G-
11.2.18.Диализ растворов белков
11.2.19. Измерение концентрации белка
11.2.20. Анализ ДКН-связывающей активности рекомбинантного белка

III.РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
III. 1.Анализ транскрипции локуса flamenco
Ш.2.Молекулярно-генетический анализ сплайсинга локуса flamenco
Ш.З.Анализ экспрессии генов системы РНК-интерференции
III.4.Анализ роли белков семейства НР1 в регуляции транспозиции
ретротранспозонов группы gypsy
III.4.1.Анализ экспрессии генов семейства hpl
III.4.
Связывание белка HP 1а с нетранслируемыми областями
ретротранспозонов группы gypsy
III.4.2.1 Получение рекомбинантного белка HP 1а
III.4.2.2. Получение генетических конструкций, содержащих регуляторные
области ретротранспозонов группы gypsy
Ш.4.2.3Гель-шифт анализ
Заключение
выводы
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ Приложение
двуцепочечные разрывы ДНК, в ответ на появлешше которых активируются соответствующие сигнальные пути [KlattenhofFet al., 2009].
У мутантов rhino обнаруживается сокращение примерно 75% тотального количества piPHK, приводящее к значительному увеличению экспрессии МГЭ. Например, экспрессия Het-A возрастает в 70 раз [Brennecke et al., 2007]. Также показано, что среди всего разнообразия малых некодирующих РНК у данных мутантов наблюдается сокращение исключительно фракции piPHK, которые участвуют за «ping-pong» механизме амплификации транскрипта-предшественника piPHK.
Анализ piPHK в ооцитах мутантов rhino методом высокопроизводительного секвенирования показал значительное сокращение комплементарных цепей piPHK в результате разрушения цикла «ping-pong» амплификации. Иммунопреципитация хроматина выявляет локализацию белка Hpld в гетерохроматиновых локусах, являющихся кластерами piPHK-предшественников (рис. 12).
МГЭ, избегающие подавление их транскрипции белком Hpld, являются движущей силой эволюции гена rhino. Существуют две взаимонеисключающие гипотезы: в линкерном домене Hpld постепенно накапливается определенное количество замен, достаточное для узнавания последовательности МГЭ. Узнавание белком Hpld интегрированной копии МГЭ ведет к появлению piPHK и осуществляется сайленсинг соответствующего МГЭ. Согласно второй гипотезе, МГЭ в преинтеграционном комплексе узнается Hpld (как в результате прямого взаимодействия с РНК/ДНК МГЭ, так и через взаимодействие с белковым аппаратом преинтеграционного комплекса) и осуществляется его направленная транспозиция в piPHK кластер [Vermaak et al., 2009].