Поверхностные сериновые протеазы SCPB и CSPA в качестве кандидатов для создания вакцин против Streptococcus Agalactiae

• Автор: Дуплик, Надежда Владленовна
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 153 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1 АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР
1.1 Общие сведения о роде Streptococcus
1.2 Streptococcus agalactiae (СГВ)
1.3 Поверхностные белки Streptococcus agalactiae, определяющие его
патогенность
1.3.1 Факторы адгезии СГВ к эпителиальным поверхностям организма человека
1.3.2 Факторы инвазия СГВ через эпителиальные барьеры организма человека
1.3.3 Факторы защиты от белков врожденного иммунитета человека
1.4 Ферменты Streptococcus agalactiae
1.4.1 Сериновые протеазы Streptococcus agalactiae
1.4.1.1 С5а пептидаза
1.4.1.2 CspA протеаза
1.4.2 Сериновые протеазы, обладающие шаперониой активностью
1.4.2.1 Протеаза IltrA (DegP)
1.4.2.2 Протеаза ClpP
1.5 Вакцины в профилактике инфекционных заболеваний
1.5.1 История развития вакцинных технологий
1.5.2 Вакцины для профилактики инфекций, вызванных СГВ
1.6 Заключение обзора
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1 Бактериальные штаммы, культуральные среды и условия роста
2.2 Выделение хромосомной ДНК
2.3 Выделение плазмидной ДНК
2.4 Определение концентрации и степени очистки хромосомной ДНК
2.5 Электрофорез ДНК в агарозном геле
2.6 Выделение ДНК из агарозного геля
2.7 Компьютерный анализ
2.8 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
2.9 Секвенирование ДНК
2.10 Гидролиз ДНК рестриктазами
2.11 Клонирование фрагмента ДНК в линейный вектор pGEM-T Easy
2.12 Клонирование фрагмента ДНК в экспрессионный вектор pQE
2.13 Трансформация культуры Е. coli плазмидной ДНК
2.14 Выделение и очистка рекомбинантного полипептида с малого объема среды
2.15 Выделение и очистка рекомбинантных полипептидов
2.16 Электрофорез полипептидов в SDS-акриламидном геле
2.17 Определение молекулярной массы и концентрации полипептидов
2.18 Иммунизация лабораторных животных
2.19 Непрямой метод иммуноферментного анализа (ИФА) для определения
титра связывания сывороточных антител с рекомбинантными полипептидами
2.20 Опсонофагоцитарный тест
2.21 Изучение протективных свойств мышиных антител, полученных к
рекомбинантным полипептидам, в опыте in vivo
2.22 Изучение токсичности рекомбинантных полипептидов
3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Компьютерный анализ первичной и вторичной структур С5а пептидазы и
протеазы CspA
3.2 Анализ штаммов стрептококков группы В на присутствие гена cspA
3.3 Секвенирование csp2 и csp3 различных штаммов СГВ и сравнительный
анализ их нуклеотидных последовательностей

3.4 Получение рекомбинантных полипептидов РЫа, РЬЗа, РЬ4а, Csp2 и Csp3
3.4.1 Клонирование фрагментов scpB:pbJa,рЬЗа, рЬ4а, и cspA: csp2 и csp3 в экспрессионной системе, и создание штаммов-продуцентов рекомбинантных полипептидов РЫа, РЬЗа, Pb4a, Csp2 и Csp3
3.4.2 Выделение и очистка рекомбинантных полипептидов РЫа, РЬЗа, РЬ4а, Csp2 и Csp3
3.5 Изучение индукции специфических антител в крови лабораторных животных на введение рекомбинантных полипептидов РЫа, РЬЗа, РЬ4а, Csp2 и Csp3 :
3.5.1 Изучение динамики изменения титра специфических антител к рекомбинантным полипептидам РЫа, РЬЗа, РЬ4а после иммунизации лабораторных животных
3.5.2 Изучение динамики изменения титра специфических антител к рекомбинантным полипептидам Csp2 и Csp3 после иммунизации лабораторных животных
3.6 Определение специфических антител к рекомбинантным полипептидам РЫа, РЬЗа, РЬ4а, Csp2 и Csp3 в сыворотках от жеищин-носительниц СГВ
3.7 Изучение опсонизирующей активности мышиных анти-РЫа, анти-РЬЗа, anra-Csp2 и анти-СзрЗ антител in vitro
3.8 Изучение протективных свойств анти-РЫа, анти-РЬЗа, ainn-Csp2 и анти-Csp3 антител на мышах, инфицированных СГВ
3.9 Исследование безопасности рекомбинантных полипептидов РЬЗа и Csp3
ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1 )|Аяр11)2 0 Нз57 ск вег195 СН-<0-::6'С '
СУБСТРАТ

)Оксианио і. Н дыра
ІСпецифі
4У1ЩП ШТді8т195 ИНТРРЖ
и Ч/ГВ !€- І і І* г‘
-СН.-СҐ СН, £Ш£ШШ£.
'Ср: С , СОСТОІ НИЕ

(С-пвптид-ЛН—СО) АОксианис ів (дН Дыра
КзіСпециф і, кармаї
СУБСТРАТ
Освобождение
Опептида
Агрі 02 0 Нз57 -СНї-С ;; Н_м-Ь!с

(С-пвптцд-МН)
ИНГЕРМЕІ ИАТ ш ИМ
Неспеци- ,С
фическая І+І*
субстрат-«
связы- Ц-Н
вающая А
площадка ои
О Н7 СН 5ег135 ГЕТРАЗЛРі
И !Е<
-СгМгН,
Неспеци-
фическаяН-Г'/ субстрат- 0=СХГ с вязы- >і-Н
вающая (У-площадка ~С
>2 НОЕ СОСТОЯ ТЛЕ
СКОЕ 6)ЛР102о СН &г195 СИ С-іЦгО
Неспеци
фическаяН-1 субстрат- «ЛГ связы- Ы-Н
вающая
площадка
Освобождение
Рисунок 2. Схема гидролиза пептида сериновыми протеазами [Доброгорская Я.И.
2003].
Активность сериновых протеаз подавляется диизопропилфосфатом и природными белковыми ингибиторами, содержащимися в злаках, овощах, яичном белке, плазме крови.
За последние десятилетия накопилось достаточно данных о различных сериновых протеазах разных стрептококковых групп. Некоторые из них являются хорошо