Разработка диагностического набора для выявления антител к возбудителям кори, краснухи и эпидемического паротита методом мультиплексного дот-анализа

• Автор: Ерш, Анна Васильевна
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 154 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ
Глава 1 ДЕТСКИЕ УПРАВЛЯЕМЫЕ ВИРУСНЫЕ ИНФЕКЦИИ И ЛАБОРАТОРНАЯ ОЦЕНКА ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ГУМОРАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА (Обзор литературы)
1Л Особенности детских вирусных управляемых инфекций
1Л Л Место краснухи, кори и эпидемического паротита в структуре ^ ^ инфекционной патологии
1Л.2Корь
1 Л.3 Краснуха
1Л.З Эпидемический паротит
1.2 Борьба с детскими вирусными инфекциями
1.2.1 Проекты снижения и элиминации ДВВИ
1.2.2 Вакцины
1.3 Оценка гуморального поствакцинального иммунитета
1.3.1. Поствакцинальный иммунитет
1.3.2 Оценка уровня антител к возбудителям ДВВИ
1.4 Мультиплексный иммуноанализ как альтернативный подход к ^ комплексному выявлению антител в препаратах крови
1.4.1 Виды, форматы и дизайн белковых матриц
1.4.2 Материалы, используемые в качестве твёрдой фазы
1.4.3 Иммобилизация биомолекул на поверхности твёрдой фазы
1.4.4 Способы распределения реагентов захвата на подложке
1.4.5 Методы детекции иммунологического связывания
1.4.6 Проблемы создания мультиплексных тестов
1.5 Выводы
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Материалы
2.2 Методы
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Отработка способов изготовления белковых матриц
3.1.1 Исследование целевых свойств материалов для изготовления ^ подложки
3.1.2 Оценка способов выкройки подложек

3.1.3 Оценка способов подготовки поверхности для иммобилизации ^ антигенов
3.1.4 Подбор условий иммобилизации антигенов на подложке
3.1.5 Выбор реагентов и условий блокирования матриц
3.2 Отработка способа применения белковых матриц
3.2.1 Отработка способа детекции иммунологического связывания
3.2.2 Оптимизация условий выполнения дот-иммуноанализа
3.3 Диагностический набор и основные приемы его изготовления и применения.
3.3.1 Состав набора
3.3.2 Белковые матрицы
3.3.3 Аналитические ванны
3.3.4 Герметизация аналитических ванн
3.3.5 Способ применения набора
3.4 Испытания экспериментальных образцов мультиплексного теста
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
Список использованных источников информации
ПРИЛОЖЕНИЕ 1 Методика приготовления компонентов диагностического набора для мультиплексного выявления в препаратах крови антител к возбудителям инфекционных заболеваний
ПРИЛОЖЕНИЕ 2 Инструкция по применению набора реагентов для одновременного выявления методом дот-иммуноанализа антител класса G к возбудителям детских вакциноуправляемых вирусных инфекций
ПРИЛОЖЕНИЕ 3 Отзыв об апробации иммуночипов для выявления антител класса G к TORCH инфекциям и ДВИ
ПРИЛОЖЕНИЕ 4 Отчет о контроле ОБТК ООО «ИмДи-сгектр» набора реагентов «ДВИ-спсктр-^О-антитела» на рабочих панелях сывороток
ПРИЛОЖЕНИЕ 5 Акт внедрения в практику результатов научных разработок

Список использованных сокращений
Аг - антиген
АГЖВ - ассоциированная паротитно-коревая вакцина Ат - антитело
БСА - бычий сывороточный альбумин
ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения
ДВВИ - детские вакциноуправляемые вирусные инфекции
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ИФА - иммуноферментный анализ
К+ - положительный контроль
К- - отрицательный контроль
КББ - карбонатно-бикарбонатный буферный раствор Ккор - коэффициент корреляции ОП - оптическая плотность
ОПкрит - критическое значение оптической плотности
ПВХ - поливинилхлорид
ПЭГ - полиэтиленгликоль
ПХ - пероксидаза хрена
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РБРК - буферный раствор для разведения конъюгата
РБРС - буферный раствор для разведения сыворотки
СВК - синдром врождённой краснухи
ФСБ - фосфатно-солевой буферный раствор
ФСБТ - фосфатно-солевой буферный раствор с твином
ЩФ - щелочная фосфатаза
IgG - иммуноглобулины класса G
IgG-Hum - иммуноглобулины класса G человека
IgM - иммуноглобулины класса М
SpA - стафилококковый белок А
ТЦД - тканевая цитопатическая доза
ЭП - эпидемический паротит
NBT - (nitroblue tétrazolium chloride)
BCIP - (bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate)
Задачей оценки поствакцинального гуморального иммунитета является не только констатация наличия или отсутствия антител к инфекционному агенту, но и определение их уровня, достаточного для защиты от заболевания. В настоящее время во многих европейских странах принят определённый стандарт уровня защитных антител. Принятые ВОЗ международные, стандартные образцы сыворотки к вирусам краснухи и кори позволили ввести в лабораторную практику количественную оценку уровня антител в международных единицах (МЕ) и дали возможность объективного сравнения результатов, полученных с помощью различных тест-систем [97, 175]. Доступные в литературе данные относительно минимальных протективных уровней антител неоднозначны. Для краснухи этот уровень варьирует от 10 до 25 МЕ/мл [63, 123, 124, 134, 171], а для кори - от 0,15 [124] до 0,5 МЕ/мл [68]. Вероятно, такая неоднозначность связана с различиями в подходах разных исследователей к комплексной оценке гуморальных и клеточных факторов иммунитета. Для эпидемического паротита защитный уровень антител до сих пор не определён.
1.3.2 Оценка уровня антител к возбудителям ДВВИ
Методы, используемые при серологическом тестировании, зависят от технического и кадрового обеспечения лаборатории. В серодиагностике ДВВИ наиболее широко применяется метод ИФЛ в постановке на микротитровальных планшетах [13]. Ряд отечественных производителей тест-систем выпускают наборы для определения антител и антигенов ко всем значимым ДВВИ. Большинство систем для ИФА позволяет проводить количественный учёт результатов, в то же время проблема стандартизации и возможности сопоставления результатов, получаемых с их помощью, оставляет желать лучшего. Так, при сравнительной оценке коммерческих наборов для ИФА отечественного и зарубежного производства, предназначенных для количественного учёта ^в-антител на основе международного стандартного образца сыворотки к вирусу краснухи, отмечено, что уровни 1§С-антител, определённые разными тест-системами, различаются. Особенно заметны расхождения результатов при оценке слабоположительных сывороток, принадлежащих пациентам групп риска [6].
Не все лаборатории располагают аппаратурой и квалифицированным персоналом для реализации ИФА, поэтому такие анализы выполняются в основном