Визуализация и мониторинг активности цитохрома Р450 ВМЗ с использованием атомно-силовой микроскопии

• Автор: Бухарина, Наталья Сергеевна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 109 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1 Цитохром Р450 ВМЗ
1.2 Энзимология единичных молекул ферментов
1.2.1 Методы измерения каталитической активности
единичных молекул ферментов
1.2.2 Уравнение Михаэлиса-Ментен для единичных
молекул ферментов
1.3 АСМ-визуализация с использованием стандартных и
сверхтонких зондов
1.3.1 АСМ для исследования активности отдельных
молекул ферментов
Глава 2. Материалы и методы
2.1 Использованные реактивы и материалы
2.2 Характеристика исследуемого белка
2.3 Методика приготовления образцов для АСМ-
измерений
2.4 Методика АСМ-визуализации ВМЗ с использованием
стандартных и сверхтонких зондов
2.4.1 Обработка АСМ-изображений
2.5 Методика АСМ-мониторинга колебаний высоты
единичных молекул ВМЗ в процессе каталитического цикла фермента
2.6 Дополнительные методы
2.6.1 Масс-спектрометрический анализ
2.6.2 Фотонная корреляционная спектроскопия
2.7 Методика АСМ-мониторинга температурной
денатурации ВМЗ

Флуоресцентный анализ
Глава 3. Результаты и их обсуждение
АСМ-визуализация и определение олигомерного состояния ВМЗ с использованием стандартных и сверхтонких зондов
Исследование олигомерного состояния ВМЗ методом фотонной корреляционной спектроскопии АСМ-визуализация ВМЗ в жидкости, вакууме и воздухе с использованием стандартных зондов АСМ-визуализация ВМЗ в воздухе и в вакууме с использованием сверхтонких зондов Определение олигомерного состояния ВМЗ из данных АСМ-экспериментов
Мониторинг активности единичных молекул ВМЗ с использованием АСМ
АСМ-измерения колебаний высоты ВМЗ на разных стадиях каталитического цикла фермента Температурная зависимость средней амплитуды колебаний высоты молекул ВМЗ
Обсуждение результатов АСМ-мониторинга активности единичных молекул ВМЗ Исследование температурной денатурации ВМЗ методами АСМ и флуоресцентного анализа Флуоресцентный анализ температурной денатурации ВМЗ
АСМ-исследование зависимости олигомерного состояния ВМЗ от температуры
Обсуждение полученных результатов исследования
температурной денатурации ВМЗ
Заключение

Выводы
Благодарности
Литература

зависимости изменения высоты от времени, когда АСМ игла устанавливалась на монослое лизоцима без сканирования, в различных условиях окружающей среды: в буфере, в присутствии субстрата и ингибитора. В присутствии субстрата (олигосахарида) наблюдались колебания высоты амплитудой 1 нм и периодом 50 мс. В присутствии ингибитора эти флуктуации снижались до уровня, когда субстрат еще не добавлен. Интерпретация полученных результатов состоит в том, что флуктуации высоты соответствуют конформационным изменениям лизоцима во время гидролиза. Также возможно, что флуктуации высоты частично являются результатом разницы в высоте и эластичности переходного комплекса лизоцим-субстрат.
Аналогичный подход использовался и в работах [83, 84], где исследовали колебания антител 1§С, а также работу фермента хитозаназы. В последней работе [84] АСМ-зонд устанавливался на вершине молекулы, и записывались траектории флуктуации вершины молекулы длительностью 0,2 с. Такие траектории были получены в чистом буфере, в присутствии субстрата (хитозан) и в присутствии двухвалентных ионов металла в качестве ингибиторов (Си2+, Мп2+ и гп2+). Флуктуации, полученные на слюде, не изменялись при изменении состава буферной смеси и имели величину 0,2 нм с длительность менее 3 мс, а также случайное распределение, эти значения могут быть связаны с термо- и электронным шумами установки. Траектории флуктуации неактивного фермента помимо аналогичного шума имели всплески высотой 0,2 нм и длительностью 15-20 мс. При добавлении субстрата на траекториях появлялись дополнительные всплески с амплитудой 0,4 нм и длительностью 2-8 мс, частота всплесков была 100-150 с'1. Эти события связывали с активностью фермента, так как заявленная активность, определенная стандартными методами составляла 120 с'1. После добавления Си2+ фермент полностью терял свою активность, т.к. не наблюдалось характерных всплесков. Мп2т и только частично уменьшили флуктуации фермента: в присутствии Мп2+ высота всплесков была также 0,4 нм, но период 20-50 мс и скорость 20-25 с"1. В присутствии Ъс* высота всплесков была <0,3 нм с периодом 20-50 мс, кроме