Исследование тилакоидных карбоангидраз Arabidopsis Thaliana

• Автор: Федорчук, Татьяна Петровна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 112 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Физико-химические свойства углекислоты
1.2. Значение КА в клетках животных
1.3. Фотосинтез: структура и реакции
1.3.1. Строение хлоропластов и тшакоидов
1.3.2. Преобразование энергии в тилакоидпой мембране
1.4. Гипотетическая роль КА в тилакоидах высших растений
1.5. Механизм концентрирования СО
1.5.1. СКМв клетках цианобактерий
1.5.2. СКМ СМатудотчпаа геМшгсИП как пример концентрирования углекислого газа в эукариотических зеленых водорослях
1.5.3. При других типах фотосинтеза (С4 и САМ)
1.6. Семейства карбоангидраз и механизм осуществления каталитической реакции
1.6.1. а-КА
1.6.2. р-КА
1.6.3. у-КА
1.6.4. 8-КА
1.6.5. е-КА
1.6.6. С-КА
1.7. Замещение атома цинка на другие металлы в активном центре КА
1.8. Ингибиторы и активаторы КА
1.8.1. Ингибиторы КА
1.8.2. Активаторы КА
1.9. Растворимые и мембраносвязанные КА высших растений и их место в растительной клетке
1.9.1. Плазмалеммные КА
1.9.2. Цитоплазматические КА
1.9.3. Митохондриальные КА
1.9.4. Хлоропластные КА
1.9.4.1. Стромальные КА
1.9.4.1.1. Р-КА

1.9.4.1.2. а-КА
1.9.4.2. Тилакоидные КА
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Условия выращивания растений
2.1.1. Pisum sativum
2.1.2. Arabidopsis thaliana
2.2. Проверка наличия РНК стромальной КА в листьях мутантных растений, нокаутированных по ß-KAl в A. thaliana с помощью ПЦР с обратной транскрипцией
2.3. Электрофорез ДНК
2.4. Выделение тилакоидов
2.4.1. Из листьев Р. sativum
2.4.2. Из листьев A. thaliana
2.5. Выделение тилакоидных мембран обогащенных фотосистемой 1 (ФС1-мембраны) или фотосистемой 2 (ФС1-мембраны) из листьев
A. thaliana
2.6. Характеристика препаратов фотосистем
2.7. Выделение и очистка мембраносвязанного носителя КА активности, расположенного вблизи ФС1 A. thaliana
2.7.1. Ионообменная хроматография
2.7.2. Осаждение белков ацетоном
2.7.3. Аффинная хроматография мембраносвязанных КА
2.8. Выделение фракции люменальных белков
2.8.1. Р. sativum
2.8.2. A. thaliana
2.9. Выделение и очистка растворимого носителя КА активности
2.10. Определение КА активности
2.11. Определение концентрации хлорофилла в образце
2.12. Электрофорез
2.12.1. Условия проведения нативного электофореза мембраносвязанных белков
2.12.2. Условия проведения нативного электрофореза растворимых белков
2.12.3. Условия проведения денатурирующего электрофореза
2.13. Визуализация карбоангидразы в полиакриламидном геле
2.14. Окрашивание гелей на белок
2.15. Определение молекулярной массы белков в геле
2.16. Определение содержания белка
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Выделение ФС1 и ФС2-мембран из тилакоидов A. thaliana и их характеристика
3.1.1. Влияние MgCl2 и детергентов па распределение фотосистем при разделении мембран тилакоидов A. thaliana
3.1.2. Влияние ингибиторов и детергентов на КА активность ФС1- и ФС2-мембран
3.2. Выделение и очистка КА ФС
3.2.1. КА активность в препаратах ФС1- и ФС2-мембран после проведения ионообменной хроматографии
3.2.2. КА активность «низкосолевой» и «высокосолевой» фракций после аффинной хроматографии
3.2.3. Получение препаратов ФС1-мембран в присутствии 1% альбумина
3.3. Выделение и очистка КА люмена
3.3.1. Получение люменалъных белков
3.3.1.1. P. sativum
3.3.1.2. A. thaliana
3.3.2. Свойства люменальной КА
3.3.2.1. Влияние Тритона X-100 на КА активность люмена
3.3.2.2. Влияние альбумина, дитиотрейтола (ДТТ)и EZ на КА активность
3.3.3. Выделение и очистка КА из фракции люменалъных белков
3.3.3.1. Выделение и очистка КА из фракции люменалъных белков с помощью пресса Френча
ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

псевдотримерами с тремя немного отличающимися друг от друга каталитическими центрами (Хи е1 а]., 2008). содержащими Ссі2*.
'• /cys325 у* f(l-CA
f (Туг 205)
V Leu
g-CA-m2 JL^
Рисунок 16. Наложение структуры І^-КА (показано зеленым) на структуру функционального димера (3-КА (показано синим). Воспроизведено из Xu et al., 2008.
В клетках диатомовых водорослей 5- и £^-КА. по-видимому, играют роль в фиксации диоксида углерода (Xu et al., 2008).
1.7. Замещение атома цинка на другие металлы в активном центре КА
Известно, что КА содержат Zn в активном сайте (Coleman. 1998). Но Zn :+ так же может легко замещаться другими двухвалентными металлами. И ферментативная активность при замещении цинка в активном центре а-КА такими металлами как Си2+, Мп2+, Ni2'. Fe~'. оксованадий (IV) становится довольно низкой, уменьшаясь в некоторых случаях до нескольких процентов (Coleman, 1967). КА активность Р-КА при замещении цинка на кобальт и кадмий снижалась не так сильно (Morel et al., 1994; Lee & Morel, 1995; Yee & Morel, 1996), но рентгеноструктурный анализ всех известных изоформ ферментов этого семейства показал наличие только цинка в составе его активного центра.
Замещение цинка в активном центре у-КА М. thermophila на двухвалентное железо или кобальт приводило к увеличению скорости гидратации углекислого газа (Tripp et al., 2001). Авторы даже поставили вопрос о том, какой металл входит в активный сайт у-КА М. thermophila, так как было установлено, что при выращивании клеток Е. coli на среде, содержащей железо, с последующим выделением у-КА в анаэробных условиях, в активном центре фермента содержалось железо, хотя при выращивании контрольных микроорганизмов на среде с цинком, наблюдали встраивание цинка. Однако изучение кристаллической структуры этого фермента показало присутствие в активном центре именно атома цинка (Сох et al.,2000). На сегодняшний день установлен только один представитель КА, не содержащий Zn - это Cd-KA, принадлежащая к С,-семейству (Park et al., 2007; Lane &