Фактор VIII : биохимические взаимодействия

• Автор: Саенко, Евгений Львович
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 303 с. : ил.

Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
ГЛАВА 2. Материалы и методы
2.1. Методы изучения молекулярных основ взаимодействия ГУН! с у\Л и фосфолипидами
2.2 Методы изучения молекулярных основ взаимодействия ГУН! с физиологическими активаторами - тромбином и активированным фактором X
2.3. Методы изучения молекулярных основ протеолитической инактивации БУШ
2.4. Методы изучения молекулярных основ инактивации ГУН! ингибиторными антителами больных гемофилией А
2.5. Методы исследования молекулярного механизма рецептор-опосредованного клиренса ГУШ из кровотока и регулирования активности ГУН!
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение
3.1. Молекулярные основы взаимодействия ГУШ с уЮТи фосфолипидами
3.1.1. Локализация центра связывания для фактора фон В иллебранда на факторе VIII.
3.1.2. Механизм ингибирующего действия уХУГ на связывание ГУШ с фосфолипидами
3.1.3. Роль кислой области легкой цепи ГУШ в формировании центра связывания для

3.1.4. Влияние активации ГУШ на его взаимодействие с уУГ и фосфолипидами
3.1.5. Влияние на взаимодействие легкой и тяжелой цепи в молекуле ГУШ
3.2 Молекулярные основы взаимодействия ГУШ с физиологическими активаторами -тромбином и активированным фактором X
3.2.1. Локализация сайтов связывания тромбина, ответственных за активацию фактора VIII
3.2.2. Роль С2 домена в связывании ГУШ с активированным фактором X
3.2.3. Ингибиторные антитела к ГУШ, предотвращающие его активацию фактором Ха
3.2.4. Влияние мутаций, обнаруженных в ГУШ при гемофилии А, на время жизни активированного Г VIII
3.3 Молекулярные основы протеолитической инактивации ГУШ
3.3.1. Защитное действие ингибиторных антител при инактивации ГУШ активированным протеином С
3.3.2. Защитное действие уУГпри инактивации ГУШ активированным протеином С
3.3.3. Механизм ингибирования внутренней теназы протеином Б, независимый от активированного протеина С
3.3.4. Роль В домена при инактивации ГУШ активированными протеином С и фактором X
3.3.5. Механизм инактивации ГУШ плазмином
3.4. Молекулярные основы инактивации ГУШ ингибиторными антителами больных гемофилией А
3.4.1. Картирование эпитопов ингибиторных антител больных гемофилией А на молекуле ГУШ
3.4.2. Механизмы инактивации ГУН1 ингибиторными антителами больных гемофилией А
3.5. Молекулярный механизм рецептор-опосредованного клиренса ГУШ из кровотока и регулирования активности ГУШ
3.5.1. Роль 1ЛР в эндоцитозе и клиренсе ГУШ

3.5.2. Идентификация аминокислотных остатков А2 домена FVI1I, формирующих центр связывания для LRP
3.5.3. Локализация областей LRP рецептора, вовлечённых в связывание с А2 доменом FVIII
3.5.4. Роль гепаран-сульфат протеогликанов клеточной мембраны в LRP-опосредованном эндоцитозе FVIII
3.5.5. Регулирование активности внутренней теназы VLDL рецептором
3.5.6. Молекулярные механизмы взаимодействия FVIII с другими рецепторами из семейства LDL
ГЛАВА 4. Заключение
Выводы
Благодарности
Приложение
Список сокращений и обозначений
Список литературы

Введение
Актуальность темы
Самые ранние упоминания о болезни несвёртываемости крови (гемофилии) встречаются в Египетских папирусах и в Талмуде. И, действительно, гемофилия А (классическая гемофилия), является одним из самых распространенных наследственных заболеваний свертывания и сопровождается тяжелыми
кровотечениями, нередко со смертельным исходом, и спонтанными кровоизлияниями в суставах. Гемофилия А - представляет собой наследственный дефицит фактора VIII (ЕУШ), который кодируется Х-хромосомой. Эта болезнь поражает приблизительно одного из 5000 мужчин. ЕУШ был открыт Патеком (1936-37), а в 30-е и 40-е годы были получены грубо очищенные БУШ, но его существование и сама природа гемофилии были предметом споров еще несколько десятилетий, главным образом потому, что в крови присутствует комплекс БУШ с фактором фон Виллебранда (у¥1), а не отдельный белок ЕУШ. Образование комплекса с защищает БУШ от протеаз, преждевременного участия в
коагуляции, клиренса и необходимо для поддержания нормального уровня БУШ в циркуляции, так как дефицит уУБ или нарушение его связывания с БУШ приводит к вторичному дефициту БУШ.
Каковы же причины отсутствия функционально активного БУШ при гемофилии А? Такими причинами являются большие и малые инсерции и делеции в гене БУШ, появление стоп кодонов, сплайс мутаций и миссенс мутаций. В результате этих мутаций в гене БУШ экспрессируется белок с отсутствующей или нарушенной функциональной активностью, либо экспрессия и/или секреция белка частично или полностью подавлена. Встречается также приобретенная форма гемофилии А, обусловленная развитием аутоантител к БУШ, инактивирующих его функциональную активность.
БУШ является (32-глобулином крови с молекулярным весом 293 кДа, присутствующим в плазме в довольно низкой концентрации равной 0.7 нМ. Являясь прокофактором, в процессе свёртывания крови БУШ активируется тромбином и, в меньшей степени, фактором Ха (БХа). Активированный БУШ нестабилен и спонтанно теряет активность в результате диссоциации на

область А2 домена, остатки 484-509, играет важную роль для кофакторной функции FVIIIa [104]. Сканирующий аланиновый мутагенез этой области, при котором заряженные остатки мутировали в Ala поодиночке или кластерами, показал, что один кластерный мутант FVIII, в котором Arg489, Arg490 и Lys493 были заменены на Ala, продемонстрировал значительно пониженную способность поддерживать каталитическую активность FIXa, но при этом аффинность мутанта по отношению к FIXa и FX не изменилась [105]. Интересно, что уменьшения скорости катализа не наблюдалось при мутации единичных остатков. Хотя точный механизм того, как остатки 484-509 усиливают катализ остаётся не установленным, эта область FVIIIa скорее всего модулирует каталитическую активность FIXa (kcat) благодаря общему электростатическому потенциалу.
Поскольку сайты связывания FIXa расположены как в А2 домене FVIIIa, так и в лёгкой цепи FVIII (LCh), взаимодействие с FIXa стабилизирует FVIIIa в составе теназного комплекса, где FIXa служит мостиком, соединяющим А2 субъединицу и гетеродимер А1/АЗ-С1-С2 [104]. Этот мостик понижает скорость спонтанной диссоциации А2 и увеличивает время жизни активированного FVIII в составе теназного комплекса. Непротеолитическая инактивация фосфолипид-связанного FVIIIa в присутствии FIXa описывается равновесием: FIXa-FVIIIa-PL «-» FlXa-A1/A3-C1-C2/PL + А2. Тогда как в этом уравнении значение ко,, не отличается от аналогичной константы в отсутствие FIXa [106], значение к0д (0.039 мин"1 [92]) в 10 раз ниже, что хорошо согласуется с увеличенным до 17.7 мин временем полужизни FVIIIa. Реальное стабилизирующее действие FIXa на FVIIIa, по-видимому, менее выражено, так как FIXa не только стабилизирует, но и параллельно инактивирует FVIIIa путём протеолиза по остатку Arg336 в А1 домене. Этот протеолиз удаляет С-терминальную кислотную область А1 домена (остатки 337-372), что в свою очередь значительно понижает аффинность А2 субъединицы по отношению к димеру А1336/АЗ-С1-С2 [107], поскольку удалённый фрагмент А1 домена участвует во взаимодействии с А2 субъединицей.
Таким образом, несмотря на то, что свободный активированный FVIII представляет собой очень нестабильную короткоживущую молекулу со временем полужизни около 2 минут, инактивирующуюся из-за быстрой диссоциации А