Влияние характера метилирования геномной ДНК и числа копий гена SMN2 на тяжесть спинальной мышечной атрофии

• Автор: Железнякова, Галина Юрьевна
• Шифр специальности: 03.02.07, 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 151 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Клиническая картина и диагностика спинальной мышечной атрофии
1.1.1. Классификация спинальной мышечной атрофии
1.2.1 Общая характеристика СМА региона
1.2.2 Гены SMN1 и SMN
1.2.3. Экспрессия генов SMN1 и SMN
1.2.4. Белок SMN
1.2.4.1. Функции SMN белка - продукта гена домашнего хозяйства
1.2.4.2. Нейронспецифические функции SMN
1.2.4.3. Функции SMN, специфичные для мышц
1.3. Основные модификаторы тяжести спинальной мышечной атрофии
1.3.2. Пластин 3, профилин Ila, Rho- и Rab-ГТФазы как возможные
модификаторы тяжести СМА
1.3.3 Метилирование ДНК как возможный фактор, влияющий на тяжесть СМА
1.3.4. Пролактин и другие белки, связанные с тяжестью СМА (белки апоптоза, белок ZPR1, содержащий домен «цинковые пальцы»). Связь тяжести СМА с полом
1.4 Лечение СМА
1.4.1 Фармакотерапия СМА
1.4.2 Генная терапия
1.4.3 Клеточная терапия СМА
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
2.1. Материал исследования
2.2. Методы исследования
2.2.1. Выделение ДНК из лейкоцитов крови
2.2.2. Полиморфизм конформации одноцепочечных фрагментов ДНК (Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP)) для анализа генов SMN1 и SMN
2.2.3. Проведение мультиплексной ПЦР в реальном времени для определения числа копий гена SMN
2.2.4. Полногеномный анализ профиля метилирования

2.2.5. Бисульфитное секвенирование
2.2.6. Выделение РНК из лейкоцитов крови
2.2.7. Проведение обратной транскрипции
2.2.8. Проведение ПЦР в реальном времени для определения
концентрации полученной кДНК
2.2.9. Проведение ПЦР в реальном времени для определения уровня транскриптов генов А1СОИ2 и АЯНСАР
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Определение числа копий гена БМШ у больных спинально-мышечной атрофией методом ПЦР в реальном времени
3.2. Полногеномный анализ профиля метилирования геномной ДНК у больных СМА и здоровых индивидуумов
3.3. Анализ уровня метилирования регуляторных областей генов
АЯНСАР22, СОК2АР1, СИМЕ ИСОК2, 81С23А2, ЯР
3.4. Анализ уровня экспрессии генов АКНСАР22 и ЫСОЯ
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
4.1. Число копий гена 5МУ2 как основной фактор, влияющий на тяжесть СМА
4.2. Метилирование ДНК как фактор, влияющий на развитие спинальной мышечной атрофии
ВЫВОДЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы исследования
Спинальная мышечная атрофия (СМА) - это аутосомно-рецессивное нервно-мышечное заболевание, характеризующееся дегенерацией альфа-моторных нейронов передних рогов спинного мозга. Наряду с муковисцидозом и миодистрофией Дюшенна, СМА является одной из самых тяжелых наследственных болезней, приводящих в большинстве случаев к летальному исходу. Частота встречаемости заболевания 1 на 6000-10000 новорожденных, частота носительства 1 на 35-50 человек (Biros and Forrest, 1999). СМА подразделяется на I, II, III и IV типы в зависимости от возраста начала развития симптомов и тяжести заболевания (Munsat and Davies 1992; Zerres and Rudnik-Schonebom, 1997). Развитие всех форм СМА вызвано мутациями в гене выживания моторных нейронов SMN1 (Lefebvre et al., 1995). 95% пациентов имеют гомозиготную делению 7 экзона гена SMN1, в то время как у остальных индивидуумов, страдающих заболеванием и сохранивших хотя бы одну копию гена SMN1, были обнаружены внутригенные мутации (Parson et al., 1996; Talbot et al., 1997; Parson et al, 1998). Ген SMN1 кодирует белок SMN, принимающий участие в биогенезе мяРНП и созревании пре-мРНК различных генов. SMN белок выполняет специфические функции в моторных нейронах. Так SMN вовлечен в транспорт мРНК ß-актина, организацию актинового цитоскелета через Rho-ГТФазы-ROCK путь (Hua and Zhou, 2004; Briese et al., 2005; Nölle et al., 2011). Однако точный механизм патогенеза СМА остается неясным. Существует две точки зрения на роль белка SMN в развитии СМА. Согласно первой, СМА — это непосредственное следствие дефектов в биогенезе мяРНП и сплайсинге пре-мРНК различных генов, развивающихся при пониженном уровне белка SMN. Согласно второй, в развитии СМА важную роль играют специфические функции белка SMN для моторных нейронов спинного мозга, критичные для их выживания.
Ген SMN1 имеет центромерно ориентированную копию — ген SMN2, количество которого, как было показано, может варьировать от 0 до 8, и коррелирует с тяжестью СМА (Lefebvre et al., 1995; Feldkotter et al., 2002). Ген SMN2 не способен полностью компенсировать отсутствие гена SMN1 из-за однонуклеотидной замены в 7-м экзоне, что приводит в процессе альтернативного сплайсинга к формированию мРНК гена SMN2, лишенной 7 экзона, снижению количества полноразмерной мРНК гена SMN2 и, соответственно, образованию нестабильного, неполноразмерного белка SMN (Lefebvre et al., 1997). Тем не менее, с гена SMN2 может считываться около 20% полноразмерной мРНК, следовательно, образуется небольшое количество функционального белка SMN.

Влияние препаратов на уровень FL-SMN мРНК и белка SMN авторы оценивали на культуре клеток фибробластов, полученных от пациентов со СМА, органотипической культуре клеток гиппокампа крыс, культуре мотонейронов крыс и культуре гиппокампа мозга человека, полученной в ходе хирургической операции по эпилепсии. Как было показано, SAHA повышает экспрессионный уровень гена SMN2 во всех культурах, включая клетки культуры мозга человека. Причем свое действие препарат оказывал в микромолярных количествах и в отличие от других проанализированных веществ обладал очень низким уровнем токсичности. SAHA не обладает избирательностью в ингибировании деацитилаз гистонов определенного класса, в то время как ВК способна ингибировать деацитилазы гистонов как I, так и II класса только при применении в высоких концентрациях (Hahnen et al., 2006). Исследование SAHA на СМА модельных мышах выявило увеличение площади нервно-мышечных соединений у животных, принимающих препарат. Добавление SAHA в воду беременным самкам со СМА позволило более чем вдвое уменьшить количество рожденных мертвых детенышей. Учитывая тот факт, что SAHA является препаратом, разрешенным для лечения рака, авторы заключают, что исследование влияния SAHA на течение СМА может быть продолжено в клинических испытаниях (Riessland et al., 2010). Совсем недавно было показано, что применение SAHA способствует не только повышению уровня SMN белка, но также увеличению веса у мышей с тяжелой формой СМА и почти полному восстановлению моторной функции на десятый день постнатального развития. На десятый день постнатального развития для мышей с тяжелой формой СМА обычно характерны тяжелые сосудистые нарушения, с более чем 80% снижением плотности сосудов в скелетных мышцах. Лечение SAHA способствовало повышению плотности сосудов, таким образом, модулируя сосудистые дефекты при тяжелой форме СМА (Somers et al., 2013).
LBH589 (панобиностат) - лекарство, разрешенное в противораковой терапии, было протестировано на способность увеличивать уровень белка SMN. Гарбес с соавторами показали, что в фибробластах, полученных от пациентов со СМА, обработанных LBH589, наблюдается 2-3-кратное увеличение FL-SMN мРНК, 10-кратное увеличение SMN белка. Также было показано, что количество СМА-фибробластов, содержащих ядерные структуры «gems», увеличивается при обработке LBH589. Повышенное образование белков Gemin 2 и Gemin 3, входящих в состав SMN комплекса также индуцируется при обработке фибробластов LBH589. По механизму действия LBH589 относится к ингибиторам деацетилаз гистонов I и II класса. Вещество индуцирует экспрессию гена SMN2 путем НЗК9-гиперацетилирования гистонов, связанных с промотором гена SMN2.