Исследование влияния структуры липополисахаридов на функциональные ответы клеток миелоидного ряда

• Автор: Волошина, Евгения Валерьевна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 127 с. : ил.

Список условных сокращений
1. Обзор литературы
1 Л.Липополисахариды, структура и биологическая активность
1.2.Рецепторы, участвующие в доставке ЛПС и передаче сигнала в клетку
1.3.ЛПС-зависимое праймирование нейтрофилов
1.3.1. Изменение цитоскелета клетки
1.3.2. Реорганизация микрофипаментов цитоскелета
1.3.3. ТЫ14-опосредованный фагоцитоз
1.4.ИАБРН-оксидазный комплекс и роль праймирования в его сборке
1.4.1. Сборка ИАОРН-оксидазного комплекса
1.4.2. Рецептор-опосредуемая продукция АФК
1.5.Влияние структуры ЛПС на активацию внутриклеточных сигнальных путей и синтез цитокинов
1.6. Активация клеток приобретенного иммунитета ЛПС
Приложение*. Промономиелоцитарная линия клеток ТНР
2. Материалы и методы исследования
2.1 .Материалы
2.2.Объекты исследования
2.3.Получение ЛПС из ЯИоАоЬас1ег сарзи1аШ5
2.3.1. Очистка ЛПС
2.3.2. Определение качественного состава ЛПС методом электрофореза в вертикальном пластинчатом геле по Крауссе [Кгаивв et а!., 1988]
2.3.3. Определение ЛПС по реакции с карбоцианиновым красителем

2.3.4. Определение содержания КДО в препаратах ЛПС по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой
2.4.Культивирование бактерий E. coli К12
2.4.1. Получение FlTC-меченых клеток E. coli Kl2
2.5.Выделение мононуклеаров и нейтрофилов из периферической крови человека
2.6.Праймирование нейтрофилов липополисахаридами
2.6.1. Регистрация образования активных форм кислорода (АФК) хемилюминесценцентным методом
2.6.2. Регистрация образования АФК хемилюминесценцентным методом в условиях подавленной сборки цитоскелета
2.7.Проведение реакции фагоцитоза с FITC-мечеными клетками E. coli К12
2.8.Дифференцировка и активация ТНР-1 клеток
2.9,Определение концентрации TNF-a и IL-6 в пробах
2.10. Оценка экспрессии рецепторов на моноцитах и ТНР-1 клетках методом прямого иммунофлуоресцентного окрашивания
2.11. Определение синтетической активности лимфоцитов методом микроспектрального флуоресцентного анализа
3. Результаты и их обсуждение
3.1.Исследование влияния структуры эндотоксинов на праймирование нейтрофилов по оценке уровня дыхательного взрыва
3.2.Влияние цитохалазина на дыхательный взрыв праймированных нейтрофилов
3.3.Исследование функциональных ответов дифференцированных ТНР
клеток на ЛПС разной структуры
3.3.1. Исследование уровня экспрессии рецепторов к ЛПС на
поверхности ТНР-1 клеток

3.3.2. Исследование влияния ЛПС на синтез провоспалителъных цитокинов ТЫР-а и 1Ь-6 дифференцированными ТНР-1 клетками
3.4.Исследование функциональных ответов фагоцитов на ЛПС разной структуры
3.4.1. Исследование уровня экспрессии рецепторов к ЛПС на поверхности моноцитов крови человека
3.4.2. Исследование влияния ЛПС на синтез провоспалителъных цитокинов ТИР-а, 1Ь-6 мононуклеарами крови человека
3.5.Влияние структуры ЛПС на синтетическую активность лимфоцитов человека
Выводы
Список литературы

Окрашивание геля проводили аммиакатом серебра по методу Тсаи [Tsai & Frasch, 1982]. После фиксации гель помещали на 30 мин в 100 мл раствора, содержащего 0,7% NaI04, 40% этанола и 5% уксусной кислоты. Затем гель трижды промывали водой и помещали в свежеприготовленный раствор окрашивающего реагента (аммиаката серебра) на 10 мин. Далее гель промывали тщательно с трехкратной сменой дистиллированной воды и проявляли зоны ЛПС раствором формальдегида (0,5 мл 37% формальдегида в 200 мл 0,005% раствора лимонной кислоты). Окрашивание проводили в течение 10 мин. Затем гель переносили в 10% раствор уксусной кислоты для остановки реакции и промывали водой.
* Приготовление аммиаката серебра: к 3 мл концентрированного раствора аммиака прибавляли 28 мл 0,1 н раствора NaOH и 5 мл 20% раствора AgNOj, смесь встряхивали до исчезновения коричневого осадка и доводили объем смеси до 150 мл дистиллированной водой.
2.3.3. Определение ЛПС по реакции с карбоцианиновым красителем
Взаимодействие карбоцианинового красителя с ЛПС ведёт к образованию окрашенного комплекса с характерным максимумом поглощения в интервале 450-478 нм, тогда как взаимодействие с другими типами макромолекул (белками, полисахаридами и нуклеиновыми кислотами) характеризуются другими характеристиками спектра [Janda & Work, 1971].
К 0,5 мл водного или буферного раствора пробы, содержащего 0,5-10 мкг ЛПС, добавляли 0,2 мл 0,03 М натрий-ацетатного буфера, pH 4,05 и 0,3 мл красящего реактива*. Смесь помещали в темноту на 5 мин, после чего немедленно измеряли оптическую плотность при 472 нм против воды. Регистрацию спектров проводили на спектрофотометре “Hitachi” (Япония).
*Красящий реактив: 1 мг карбоцианинового красителя растворяли в 2 мл реактива А (смесь равных количеств 1,4-диоксана и 0,03 М натрий-ацетатного буфера pH 4,05). После растворения добавляли 8 мл 0,03 М