Исследование специфической активности полиэпитопных T-клеточных ВИЧ-1 иммуногенов, полученных с использованием различных стратегий проектирования

• Автор: Регузова, Алёна Юрьевна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 150 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Введение
Научная новизна работы
Теоретическая и практическая значимость работы
Положения, выносимые на защиту
Апробация работы и публикации
Личный вклад автора
Благодарности
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 .Мировой опыт по разработке вакцины против ВИЧ
1.2. Дизайн вакцины для индукции Т-клеточного иммунного
ответа против ВИЧ-
1.2.1. Особенности презентации Т-клеточных вакцин
1.2.2. Разрабатываемые полиэпитопные вакцины против ВИЧ-1 28 для индукции Т-клеточного ответа
1.2.3. Стратегии конструирования полиэпитопных вакцин
1.3. Методы исследования Т-клеточного иммунного ответа
1.3.1. Методы исследования Т-клеточной пролиферации
1.3.2. Методы исследования клеточной цитотоксичности
1.3.3. Методы определения цитокинов
1.3.4. Методы определения антиген-специфических Т-клеток, 45 продуцирующих цитокины
1.3.5. Методы количественного определения 49 антиген-специфических Т-клеток
Заключение по обзору литературы
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Основные компоненты для приготовления питательных 54 сред, реактивы, реагенты и прочие материалы
2.2. Плазмиды
2.3. Бактерии
2.4. Культура клеток

2.5. Растворы
2.6. Методы
2.6.1. Проектирование искусственных полиэпитопных Т-клеточных 58 ВИЧ-1 иммуногенов TCI-N, TCI-N2 и TCI-N
2.6.2. Синтез генов и конструирование рекомбинантных плазмид
2.6.3. Трансформация клеток E. coli BL21 плазмидными ДНК
2.6.4. Наработка препаративного количества рекомбинантных 59 плазмидных ДНК
2.6.5. Выделение и очистка плазмидной ДНК
2.6.5.1 Лизис бактериальных клеток
2.6.5.2. Удаление РНК из раствора плазмидной ДНК
2.6.5.3. Осаждение плазмидной ДНК
2.6.5.4. Дробное фракционирование плазмидной ДНК 61 этиловым спиртом
2.6.5.5. Очистка плазмидной ДНК от примесей низкомолекулярной РНК
2.6.5.6. Измерение концентрации раствора ДНК
2.6.6. Рестрикционный анализ плазмидной ДНК
2.6.7. Трансфекция эукариотических клеток сконструированными 62 плазмидами
2.6.8. Электрофорез белков в полиакриламидом геле
2.6.9. Вестерн-блот анализ
2.6.10. Внутриклеточная детекция полиэпитопных белков TCI-N, 65 TCI-N2 и TCI-N3 с использованием моноклональных антител,
меченых F1TC
2.6.11. Иммунизация лабораторных животных сконструированными 66 ДНК-вакцинными конструкциями и сбор образцов для анализа
2.6.12. Исследование ВИЧ-специфического иммунного ответа 66 у мышей линии BALB/c после ДНК-иммунизации
2.6.12.1. Выделение спленоцитов иммунизированных животных
2.6.12.2. Стимуляция спленоцитов иммунизированных животных
2.6.12.3. Внутриклеточное окрашивание цитокинов
2.6.13. Определение количества ВИЧ-1 Env- и Gag-специфических

СБ8-ь Т-лимфоцитов у вакцинированных добровольцев с использованием пептид-МНС-пентамеров
2.6.14. Статистическая обработка полученных результатов 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Проектирование искусственных ВИЧ-1 полиэпитопных Т-клеточных иммуногенов ТС1-1Ч, ТО-М2 и ТО-МЗ
3.1.1. Выбор Т-клеточных эпитопов
3.1.2. Дизайн последовательности целевых Т-клеточных иммуногенов
3.1.3. Проектирование целевых Т-клеточных иммуногенов
3.1.4.Конструирование рекомбинантных плазмид, кодирующих полиэпитопные Т-клеточные иммуногены
3.1.5. Наработка препаративного количества ДНК рекомбинантных плазмид
3.2. Изучение экспрессии целевых генов в клетках 293Т, трансфицированных рекомбинантными плазмидами
3.2.1. БОБ-РАСЕ и вестерн-блот анализ
3.2.2. Внутриклеточная детекция полиэпитопных белков ТС1-Ы, ТО-М2 и ТСЫЧЗ с использованием моноклональных антител 29Е2, меченых ИТС
3.3. Исследование иммуногенности ДНК-вакцинных конструкций, кодирующих полиэпитопные иммуногены ТО-Ы, ТС1-Ы2 и ТС1-Ю
3.3.1. Иммунизация лабораторных животных сконструированными ДНК-вакцинами и сбор образцов
3.3.1.1. Выбор параметров для исследования ВИЧ-специфического иммунного ответа, индуцированного вакцинацией
3.3.1.2. Выбор метода и протокола для исследования ВИЧ-специфического иммунного ответа, индуцированного вакцинацией
3.3.3. Изучение способности искусственных полиэпитопных иммуногенов ТС1-М, ТС1-М2 и ТО-ЫЗ стимулировать ВИЧ-специфические ответы С04+ и С08+ Т-лимфоцитов
3.3.4. Исследование влияния дополнительных сигнальных последовательностей в структуре полиэпитопных иммуногенов на

супертипами HLA, т. е. молекулами HLA, наиболее представленными в человеческой популяции, имеют больше шансов на успех. Так, например, Т-клеточная вакцина, построенная на основе эпитопов, рестриктированных тремя супертипами HLA-A2, A3 и В7, способна вызывать вирус-специфические Т-клеточные ответы у 80-90 % лиц мировой популяции (Sette and Sidney, 1998).
3) Повышение аффинных характеристик CD8+ ЦТЛ-энитопов
Повышение аффинных характеристик ЦТЛ-эпитопа можно осуществить
несколькими путями:
- Повышение аффинности связывания эпитопов с молекулами МНС путем модификации последовательности эпитопов. Показано, что такой подход может сделать субдоминантный эпитоп доминантным, увеличивая его конкурентные способности связывания со свободными молекулами МНС (Pogue et al., 1995; Berzofsky et al., 2001);
- Повышение аффинности комплекса пептид-МНС к Т-клеточному рецептору. Улучшенные характеристики связывания комплекса пептид-МНС с Т-клеточным рецептором были получены на основе изменения последовательности пептида в работе Тангри и др. (Tangri et al., 2001);
- Генерирование кросс-реактивных Т-клеток широкого спектра специфичности, эффективных в отношении большого количества вирусных штаммов. Этот подход был применен с использованием CD8+ ЦТЛ-эпитопа из вариабельного сегмента белка Env ВИЧ-1, в котором замена одного аминокислотного остатка в ТКР-взаимодействующей области индуцировала кросс-реактивные ЦТЛ, которые распознавали множество вариантов ВИЧ-1 (Takahashi et al, 1992).
4) Использование CD4+ Т-хелерпых эпитопов, рестриктированнных молекулами МНС II класса, для усиления ответа CD8+ Т-лимфоцитов
Т-хелперы играют важную роль в стимулировании развития CD8+ Т-клеток, а также генерации Т-клеток памяти (Castellino et al., 2006). Поэтому проектируемые полиэпитопные иммуногены кроме CD8+ ЦТЛ-эпитопов должны содержать CD4+ Т-хелперные эпитопы.
5) Рациональная стратегия повышения иммуногенности вакцины должна обеспечивать максимальную экспрессию генов, кодирующих целевые иммуногены, эффективный процессинг продуктов экспрессии генов и презентацию