Структура и свойства фитаспазы Nicotiana tabacum

• Автор: Тужиков, Александр Иванович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 126 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СОДЕРЖАНИЕ
Список условных обозначений
1. Каспазоподобная иротеолитическая активность
и ее участие в программированной смерти растительных клеток
(обзор литературы)
1.1 Программированная клеточная смерть
1.2 Каспазы
1.3 Белковые ингибиторы каспаз животных
1.4 Специфические пептидные ингибиторы каспаз животных
1.5 Флуорогенные субстраты каспаз живо гных
1.6 VPE (Vacuolar processing enzyme)
1.7 Каспазоподобная активность протеасомы
1.8 Метакаспазы
1.9 Саспазы
1.10 Каспазоподобная активность в клетках листьев табака. Фитаспаза
1.11 Субтилизин-подобные протеазы
1.12 Синтез и активация субтгошзнн-подобных протеаз
1.13 Активный центр субтнлизин-подобных протеаз
1.14 Субстрат-связывающие центры субтилизин-подобных протеаз
2. Структура и свойства фитаспазы
Nicotiana tabacum (Результаты и обсуждение)
2.1 Бионнформатическая характеристика фитаспазы
2.2 Рекомбинантная фитаспаза протеолитически активна,
и ее активность зависит от Ser537 в активном центре
2.3 Продомен фитаспазы подвергается
автокаталитическому отщеплению (процессингу)
2.4 Автокаталитнческий процессинг фитаспазы
происходит аспартат-специфично
2.5 Процессинг фитаспазы необходим для протеолитической активности
2.6 Автокаталитнческий процессинг'продомена
необходим для секреции фитаспазы

2.7 Сигнальный (лидерный) пептид направляет фитаспазу на путь секреции
2.8 При индукции ПКС фитаспаза перемещается из апопласта внутрь клетки
2.9 Использование мономерного белка-таймера
для наблюдения за перемещением фитаспазы во время ПКС
2.10 Фитаспаза находится в апопласте в активном состоянии
2.11 Биоинформатический подход к изучению специфичности фитаспазы
2.12 Модель функционирования фитаспазы в растительной клетке
3 Материалы и методы
3.1 Используемые реактивы и приборы
3.2 Штаммы прокариот
3.3 Линии растений
3.4 Векторы и плазмиды
3.5 Антитела
3.6 Буферные среды и растворы
3.7 Реактивы для выделении плазмид
3.8 Среды
3.9 Растворы для работы с агробактериями
3.10 Работа с клетками E. coli
3.10.1 Приготовление компетентных клеток£. coli
3.10.2 Трансформация клеток E.coli
3.11 Работа с ДНК
3.11.1 Выделение плазмид
3.11.2 Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции
3.11.3 Обработка концов фрагментов ДНК полимеразой фага Т
3.11.4 Обработка концов фрагментов ДНК фрагментом Кленова
3.11.5 Лигирование ДНК
3.11.6 Амплификация фрагментов ДНК (полимеразная цепная реакция, ПЦР)
3.11.7 Электрофорез ДНК в агарозном геле
3.11.8 Элюцня фрагментов ДНК из агарозного геля
3.11.9 Использованные олигонуклеотиды (праймеры)
3.11.10 Направленный мутагенез
3.11.11 Схемы клонирования
3.11.11.1 Плазмида pUC19-(6-639)NtPhytClonelO
3.11.11.2 Плазмида pSLl 180-(K.pnI)+(6-639)NtPhytC!onel0-(639-831)
NtPhytCloneô
3.11.11.3 Плазмида pUC19_NtPhyt
3.11.11.4 Плазмида pBluescript JlSK(+)_NtPhyt_GST
3.11.11.5 Плазмида pRTL2_NtPhvt_GST
3.11.11.6 Плазмида pLH7000delta_NtPliyt-GST(WT)
3.11.11.7 Плазмида pBluescript 11SK(+)_EGFP
3.11.11.8 Плазмида pLH7000delta_NtPIiyt-EGFP(WT)
3.11.11.9 Плазмида pLH7000delta_NtPhyt-EGFP-[His]6(WT)
3.11.11.10 Плазмида pSLl 180_NtPhyt(AS)
3.11.11.11 Плазмида pLH7000delta_NtPhyt-GST(S537A)
3.11.11.12 Плазмида pLH7000delta_NtPhyt-F,GFP(S537A)
3.11.11.13 Плазмида pLH7000delta_NtPhyt-GST(C540A)
3.11.11.14 Плазмида pUC 19_(LF)NtPhyt
3.11.11.15 Плазмида pLH7000delta_NtPhyt-EGFP-[His]6(LF)
3.11.11.16 Плазмида pSL 1180_D 117TTHT
3.11.11.17 Плазмида pLH7000delta_NtPhyt-EGFP-[His]6 (D117E)
3.11.11.18 Плазмида pLH7000delta_NtPhyt- EGFP-[His]6 (D117A)
3.11.11.19 Плазмида pLH7000delta_NtPhyt- EGFP-[FIis]6(M4)
3.11.11.20 Плазмида pSLl 180 FT
3.11.11.21 Плазмида pSLl 180_FT_GST
3.11.11.22 Плазмида pLH7000deltaJNtPhyt-FT-GST
3.12 Продукция и выделение рекомбинантных белков
3.12.1 Трансформация агробактерий плазмидными конструкциями
3.12.2 Культивация агробактерий, предшествующая инфильтрации
3.12.3 Подготовка агробактерий к инфильтрации
3.12.4 Инфильтрация листьев растений Nicotiana benthamiana агробактсриями
3.12.5 Коинфильтрация листьев растений Nicotiana benthamiana
агробактериями для изучения локализации фитаспазы
3.12.6 Выделение рекомбинантных белков
3.12.7 Выделение рекомбинантных белков с тэгом GST
3.12.8 Выделение рекомбинантных белков с тэгом EGFP-[His]
3.12.9 Электрофоретическое фракционирование белков
с помощью системы Лэммли
гидролиз, что также подтверждало гипотезу о том, что в апоптотических клетках табака гидролиз репортерного белка ОЕР-Уй020 происходил за счет аспартат-специфичной каспазо-подобной активности, соответствующей специфичности каспазы-3 человека.
Рисунок 5. Схематическое изображение репортерной конструкции GFP-VirD2Ct (А). Фрагмент электрофореграммы, полученной при анализе гидролиза GFP-VirD2Ct фитаспазой (NtPhyt) (Б).
Вскоре из листьев Nicotiana tabacum была выделена протеаза, гидролизующая GFP-VirD2Ct. Ее способность гидролизовать GFP-VirD2Ct по сайту TATD была подтверждена методами масс-спектрометрии. Первичная характеристика растительной протеазы (гидролизовавшей белок GFP-VirD2Ct по сайту TATD) показала, что активность данного фермента не подавлялась bio-DEVD-CHO (ингибитором каспазы-3 человека), но подавлялась пептидным ингибитором bio-TATD-CHO, специально созданным на основе места узнавания в белке GFP-VirD2Ct. Кроме того, ряд пептидных ингибиторов каспаз животных (в частности, Ac-VEID-СНОи Ac-VAD-CHO) ингибировали активность выделенного фермента. Было показано, что пептидный ингибитор bio-TATD-CHO заметно замедлял развитие признаков ГО, вызванного вирусной инфекцией. Это давало основания полагать, что специфическое ингибирование выделенного каспазоподобного фермента может вести к подавлению развития признаков ПКС.
Таким образом, функционально эта растительная протеаза могла рассматриваться как растительный аналог каспаз: ее активация наблюдалась при индукции ПКС, в ходе которой она гидролизовала белки-субстраты после остатка аспарагиновой кислоты в специфическом сайте узнавания; замена аспартата в данном сайте предотвращала гидролиз; протеолитическая активность каспазоподобной протеазы подавлялась ингибитором, созданным на основе сайта узнавания; ингибирование фермента приводило к подавлению развития ПКС. Найденная растительная каспазоподобная протеаза (plant caspase-like protease) была названа - «фитаспаза» (phytaspase, pAyto—растительный (лат.), asp - специфичный в отношении остатка аспарагиновой кислоты, ase - фермент) [1].