Влияние генов rol агробактерий на процессы роста и вторичного метаболизма в культурах трансгенных клеток Rubia cordifolia

• Автор: Шкрыль, Юрий Николаевич
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Владивосток
• Количество страниц: 92 с. : ил.

СОДЕРДЖАНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Общая характеристика марены сердцелистной (Rubia cordifolià)
1.1.1. Ботаническая характеристика
1.1.2. Фитохимическая характеристика
1.1.3. Фармакологические и другие свойства
вторичных метаболитов марены
1.2. Культуры растительных клеток, продуценты
антрахинонов
1.3. Генетическая инженерия как метод биотехнологии
1.3.1. История и значение генетической инженерии
1.3.2. Генетическая инженерия растений
1.3.3. Агробактерии как векторы для трансформации
высших растений
1.3.4. Ti-плазмиды агробактерий
1.3.5. Ri-плазмиды агробактерий
1.3.6. Механизм переноса Т-ДНК
1.3.7. Плазмиды агробактерий как векторы для
трансформации
1.4. Метаболическая инженерия. Модификация
шикимат—фенилаланинового биосинтетического пути
1.5. Гены roi
1.5.1. Краткая история проблемы
1.5.2. Характеристика генов roi
1.5.3. Опухолеобразующая функция генов roi
1.5.4. Гены roi как активаторы вторичного метаболизма
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2. МАТЕРИАЛЫ
2.1. Растения
2.2. Бактерии и плазмиды
2.3. Среды для культивирования культур

2.4. Реактивы
3. МЕТОДЫ
3.1. Получение клеточных культур марены
3.1.1. ^трансформированная культура марены
3.1.2. Культура марены, трансформированная геном го1С
3.1.3. Культура марены, трансформированная геном го1В
3.2. Культивирование бактериальных культур
3.3. Культивирование каллусных культур
марены сердцелистной
3.4. Эксперименты с ингибиторами
3.5. Выделение плазмидной ДНК
3.6. Доказательство трансгенности полученных культур
3.6.1. Выделение тотальной растительной ДНК
3.6.2. Полимеразная цепная реакция
3.7. Доказательство экспрессии генов го1
в трансгеиных культурах
3.7..1. Выделение тотальной растительной РНК
3.7.2. Обратная транскрипция
3.7.3. Полимеразная цепная реакция
3.7.4. Секвенирование го1В и го1С продуктов
3.8. Секвенирование участка гена актина марены
на матрицах ДНК и кДНК
3.9. Анализ экспрессии кальцийзависимых протеинкиназ
3.10. Анализ экспрессии изохоризматсинтазы
3.11. Химический анализ антрахинонов
3.12. Измерение концентрации внутриклеточного кальция методом лазерной флуоресцентной микроскопии с
использованием зонда Р1ЖА-2АМ
3.12.1. Приготовление клеток
3.12.2. Измерение концентрации кальция
3.13. Статистический анализ
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
4.1 Характеристика клеточных культур марены
4.1.1. Клеточные культуры марены

4.1.2. Доказательство трансгенности го!В и го1С культур марены
4.1.3. Доказательство экспрессии генов го1В и го1С
в трансгенных культурах
4.1.4. Синтез антрахинонов в культурах марены
4.2. Регуляция биосинтеза антрахинонов в трансгенных культурах марены
4.2.1. Гены го1 активируют экспрессию изохоризматсинтазы
4.2.2. Влияние элиситоров на синтез антрахинонов
в культурах марены
4.2.3. Влияние ингибитора протеинфосфатаз,
кантаридина, на синтез антрахинонов
4.2.4. Влияние окадаевой кислоты и стауроспорина
4.2.5. Ингибитор ИАОРН-оксидаз, ИР1, не влияет
на синтез антрахинонов в культурах марены
4.2.6. Влияние ингибитора тирозинфосфатаз, РАО,
на рост и синтез антрахинонов
4.3. Кальциевая сигнальная система в регуляции биосинтеза
антрахинонов в трансгенных культурах марены
4.3.1. Рост трансгенных культур в условиях дефицита кальция
4.3.2. Влияние ингибиторов кальциевых каналов на рост
и содержание антрахинонов в культурах марены
4.3.3. Дефицит кальция блокирует
кантаридин-стимулированный синтез антрахинонов
4.3.4. Устойчивость го/Я-культуры к дефициту кальция
снимается ингибитором тирозинфосфатаз
4.3.5. Влияние перекиси водорода на внутриклеточную
концентрацию кальция в культурах марены
4.3.6. Изменение экспрессии кальцийзависимых протеинкиназ
в культурах марены
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
6. ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

источника света ксеноновой лампы 75W Optosource и монохроматора "Optoscan" (Cairn Research Ltd, Англия) и цифровой CCD видеокамеры "ORCA-ER С4742-95" (Hamamatsu Photonics К.К., Япония). Регистрацию флуоресценции проводили с объективом FLUAR 40х / 1.30 Oil (Zeiss, Германия) под масляной иммерсией.
Раствор Н2О2 для индукции входа Са2+ в клетки вносили в объеме 10 мкл в камеру с клетками. Флуоресценцию зонда Fura-2 возбуждали попеременно при А,=340нм/380нм. Набор светоделительных фильтров HQ Fura (Chroma Technology Corp., США) был установлен для визуализации флуоресценции зонда Fura-2 в цитоплазме клеток при А.=510 нм. Захваченные видеокамерой изображения переносили в IBM-совместимый компьютер Pentium-IV с помощью специализированной платы видеозахвата Firewire (США) и сохраняли в компьютерном жестком диске в виде графических видеофайлов. Интенсивность уровня флуоресценции клеток и оценка динамики изменения концентрации Са2+ в клетках под воздействием препаратов была определена инструментальными средствами программы "AQM Advanced 6" (Kinetic Imaging Ltd., Англия). Результаты выражали как отношение интенсивности флуоресценции Fura-2, полученной при облучении клеток светом с длиной волны 340 нм, к интенсивности
флуоресценции, полученной при облучении клеток светом с длиной волны 380 нм,
выраженную в относительных единицах. Далее рассчитывали разницу (Д, дельта) между
максимумом этого показателя при увеличении концентрации кальция к показателю стадии покоя клеток. Статистическую обработку результатов, вычисление средних значений и стандартной ошибки эксперимента и построение графиков проводили с помощью компьютерной программы SigmaPlot 3.02 (Jandel Corporation, США).
3.13. Статистический анализ
Результаты всех экспериментов были обработаны при помощи программы Statistica, версия 5.0. Все данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка (С.О.). Полученные данные проверены по спаренному критерию Стьюдента (значения каждого эксперимента сравнивали с контролем). Уровень значимости в 0,05 был выбран как
минимальное значение статистической разницы во всех экспериментах.