Исследование нуклеотидсвязывающих центров митохондриальной F1-АТФ-АЗЫ

• Автор: Вульфсон, Евгений Наумович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 152 c. : ил

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ
АДФ - аденозин-57 -дифосфат
АМФ - аденозин-5/ -монофосфат
АМФ-РИР - аденозин-Б'-(^ , >^-имидо) трифосфат
АТФ - аденозин-5/-трифосфат
К *
£-АТФ-1,М - этеноаденозин-5 -трифосфат
АТФ-аза, Н+-АТФ-аза - аденозин-5-трифосфатаза (К.Ф. 3.6.1.31.)
да - гуанозин-Б^-дифосфат
ГТФ - гуанозин-5/-трифосфат
изо-ГТФ - 2-оксиаденозш-5/ -трифосфат
ДДС-А1а - додецилсульфат натрия
ДМСО - диметилсулъфоксид
ДМФА - диметилформамид
ИДФ - инозин-5У-дифосфат
ИМФ-РНР - инозин-5/ -(^ , -у -имидо)трифосфат
ИТФ - инозин-5'-трифосфат
Мопс - З-(М-морфолино)-пропан сульфоновая кислота
уйГ - разность электрохимических потенциалов ионов водорода на сопрягающей мембране
НАД’Н - никотинамидадениндинуклеотид восстановленный
НТФ - нуклеозид-5'-трифосфат
НАБ-АДФ-З' (2' )-(2-нитро-4-азидобензоил)-аденозин-5/-дифосфат НАБ-АТР-3'(2' )-(2-нитро-4-азодобензоил)-аденозин-5'-трифосфат Фн - неорганический фосфат
фактор ¥о - мембранный компонент АТФ-азного комплекса фактор ?■£, -Рд-АТФ-аза - растворимый каталитический компонент АТФ-азного комплекса ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ГЛАВА I. СТРОЕНИЕ ГрАТФ-азы
1.1. Молекулярный вес и субъединичный состав ГрАТФ-азы
1.2. Стехиометрия субъединиц в молекуле ЕрАТФ-азы
1.8. Функции скбъединиц £рАТФ-азы
1.4. Пространственная структура РрАТФ-азы
ГЛАВА 2. КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ГрАТФ-азы
2.1. Общие каталитические свойства ГрАТФ-азы
2.2. Связьшание ^рАТФ-азой нуклеотидов и неорганического фосфата
2.3. Влияние АДФ на каталитические свойства -ГрАТФ-азы
2.4. Кооперативность взаимодействия между каталитическими центрами ГрАТФ-азы. Модель поочередно функционирующих каталитических центров
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА I. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1.1. Препаративные методы
1.2. Аналитические методы
ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
2.1. Прочное связывание адениновых и гуаниновых нуклеотидов митохондриальной ГрАТФ-азой.
Влияние связанных нуклеозиддифосфатов на каталитические свойства фермента

2.2. Кооперативность в связывании АДФ и неорганического фосфата в каталитическом центре митохондриальной ij-АТФ-азы
2.3. Взашлодействие митохондриальной ij-АТФ-азы с новым фотоактивируемым аналогом АТФ-3'-
(2' М2-нитро-4-азидобензоил)-аденозин-5~ трифосфатом. Локализация центра, осуществляющего одно-центровый катализ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В Ы В О Д Ы
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

В экспериментах по связыванию эквимолярных количеств нуклео-тидов -Fj-АТФ-азой, лишенной прочносвязанных нуклеотидов, фермент I мг/мл (2,8 мкЮ преинкубировали в буфере А в течение 5 мин;
MgS 04 добавляли так, чтобы его концентрация на I мМ превышала концентрацию ЭДТА. Несвязанные нуклеотиды отделяли методом гель-фильтрации с центрифугированием как описано выше, но в этом случае концентрацию свободного Mg 50^ в буфере А уменьшали до I мМ, после чего аликвоты фермента отбирали для определения АТФ-азной активности.
Связывание Fj-АТФ-азой НАБ-АТФ (НАБ-АДФ) определяли аналогично.
При расчетах молекулярную массу -Fj-АТФ-азы принимали равной 350 кДа / 18 /.
Связывание gj-АТФ-азой неорганического фосфата
Связывание фосфата нативной и лишенной прочносвязанных нуклеотидов Jj-АТФ-азой определяли по методу Пенефски / 152 / ij-АТФ-азу(2-3 mkMJпреинкубировали в буфере содержащем 0,25 М сахарозу,
40 мМ Mono-NaOH, pH 7,5, I мМ MgSO^ (буфер Б); [^ЧР]-ортофосфат, в указанных в подписях к рисункам концентрациях, с удельной радиоактивностью 4-8*10^ расп/мин/нмоль;в течение 40 мин для нативного фермента и 15 глин для фермента, лишенного прочносвязанных нуклеотидов и реконструированного с эквимолярными их количествами. Затем несвязанный фосфат отделяли методом гель-фильтрации с центрифугированием. Для измерения скорости диссоциации фосфата из комп-

лекса с Pj-АТФ-азой, фермент преинкубировали с 300 мкМ [ PJ-ортофосфата (см.выше)'и разводили в 10 раз в буфере Б,содержащем I мг/мл альбумина. Через указанные промежутки времени определяли количество неорганического фосфата, оставшегося связанным с ¥j-АТФ-азой.