Иммуноферментный анализ нейроспецифических антигенов в оценке проницаемости гематоэнцефалического барьера при перинатальном гипоксически-ишемическом поражении ЦНС (клинико-экспериментальное исследован

• Автор: Блинов, Дмитрий Владиславович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 127 с. : 27 ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В ДИССЕРТАЦИИ:
АГ - антиген АТ - антитела
ВЖК - внутрижелудочковое кровоизлияние ГВ - гестационный возраст
ГИППГМ - гипоксически-ишемическое перинатальное поражение головного
ГЭБ - гематоэнцефалический барьер
ДЦП - детский церебральный паралич
ИВЛ - искусственная вентиляция легких
ИФА - иммуноферментный анализ
КТ - компьютерная томография
МРТ - магниторезонансная томография
НСБ - нейроспецифический белок
НСГ - нейросонография
ПААТ - полиакриламидный гель
ПАФ - полный адьювант Фрейнда
ПВЛ - перивентрикулярная лейкомаляция
РИА - радиоиммунный анализ
СМЖ - спинномозговая жидкость
СЭК - субэпендимальное кровоизлияние
ЦНС - центральная нервная система
ЭЭГ - электроэнцефалография
GFAP - glial fibrillary acid protein
NSE - neuron-specific enolase
СОДЕРЖАНИЕ.
ВВЕДЕНИЕ
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Гипоксически-ишемическое поражение ЦНС в перинатальном периоде и проницаемость ГЭБ для NSE и GFAP
1.1. Особенности течения и исходы ГИППГМ
1.2. Структурно-функциональная организация ГЭБ
1.3. Содержание NSE и GFAP в биологических жидкостях при ГИППГМ как критерий оценки проницаемости ГЭБ
1.4. Экспериментальное моделирование ГИППГМ
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Твердофазный иммуноферментный анализ NSE и GFAP в биологических жидкостях
2.2. Клинико-лабораторные методы обследования
2.3. Экспериментальные исследования
2.4. Статистический анализ
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Иммуноферментный анализ нейроспецифических антигенов при ГИППГМ в клинике и эксперименте
3.1. Клинико-лабораторная характеристика обследованных детей
3.2. Характеристика используемых иммуноферментных тест-систем
3.3. Иммуноферментный анализ NSE и GFAP в сыворотке крови детей с перинатальным гипоксически-ишемическим поражением ЦНС
3.4. Исследование проницаемости ГЭБ для NSE и GFAP у крыс с моделированием ГИППГМ
3.4.1. Динамика неврологического дефицита и нарушений высшей нервной деятельности крыс после моделирования ГИППГМ
3.4.2. Иммуноферментный анализ нейроспецифических антигенов в биологических жидкостях у крыс с ГИППГМ
3.4.3. Анализ связи показателей функционального состояния организма и содержания NSE и GFAP в биологических жидкостях крыс в динамике развития патологического процесса, вызванного ГИППГМ
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
-2Р-У
ВВЕДЕНИЕ
Гипоксически-ишемическое поражение ткани мозга в перинатальном периоде является одной из основных причин смертности новорожденных, а также развития тяжелой патологии ЦНС с исходом в инвалидизацию [2,51,59,132,176,184].
У 20-50% новорожденных, перенесших системную гипоксию во внутриутробном периоде и во время родов, развиваются морфофункциональные нарушения со стороны ЦНС.
В наиболее выраженных случаях для перинатального гипоксически-ишемического поражения ЦНС характерны необратимые структурные повреждения ЦНС, которые клинически могут проявляться в виде различных форм гидроцефалии, вторичной микроцефалии, детского церебрального паралича, судорожного синдрома и практически всегда сопровождаются задержкой психомоторного развития [271]. Клиническое и инструментальное обследование новорожденных не всегда дает возможность выявить степень тяжести ГИППГМ и, следовательно, не позволяет надежно прогнозировать его течение и исход [23,42,132,264,271]. Несмотря на интенсивные исследования в этой области, надёжных средств лечения последствий ГИППГМ практически нет, поскольку патогенез хронизации нейродегенеративного процесса, являющегося определяющим моментом для течения и исходов данной патологии, во многом не известен. В качестве достаточно продуктивной рассматривается гипотеза о включении аутоиммунных механизмов в патологический процесс вслед за первичным повреждением нервной ткани при ряде заболеваний (опухоли, болезнь Паркинсона, травма мозга) [14,39].
В связи с этим, в последние десятилетия отмечен возрастающий интерес к нейроспецифическим белкам (НСБ), как к сывороточным маркерам патологических процессов и травм головного мозга, в которых определенное место отводится нарушению резистентности гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) [39,80,113,116,117,210]. Одними из наиболее изученных среди них являются глиофибриллярный кислый протеин (GFAP), структурный белок промежуточных филаментов астроцитов, и нейроспецифическая енолаза (NSE) - гликолитический цитоплазматический фермент нейронов, катализирующий превращение 2-фосфоглицерата в 2-фосфоенолпируват [117,215].
В ряде исследований проведенных ранее, оценивалось состояние ГЭБ для глиоспецифических антигенов только в течение нескольких первых суток жизни
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Твердофазный иммуноферментный анализ NSE и GFAP в биологических жидкостях.
Твердофазный иммуноферментный анализ (ELIS A) NSE и GFAP в биологических жидкостях выполняли с использованием оригинальных тест-систем на основе моноклональных антител и моноспецифической антисыворотки (Рис. 1). Моноклональные мышиные антитела к NSE и GFAP, реагирующие с видонеспецифическими эпитопами NSE и GFAP человека и крысы, были получены в лаборатории иммунохимии ГНЦССП им. В.П. Сербского.
Высокоочищенные препараты NSE и GFAP были получены по оригинальной методике [130,190]. При сопоставлении с коммерческими образцами NSE (RDI, США) и GFAP (Chemicon, США), данные препараты были полностью идентичны.
Полученные препараты были использованы при дальнейшей иммунизации мышей линии Bulb/C и кроликов породы «шиншилла» с целью получения моноклональных антител и моноспецифических антисывороток.
Рис. 1. Схема сэндвнч-варианта иммуноферментного анализа нейроспецифических белков.
О Адсорбция антител на твердой фазе
в Внесение образцов
биологнческтк
жидкостей;
комплементарное
связывание
соответствующих НСБ с АТ.
@ Внесение конъюгата антител с ферментом; комля см сигарное связывание соответствующие вднотипов АТ кекыогта с annronasiTiNSE либо QFAP
О Внесение субстратной смеси (р) для зня сна конъюгата, изменение цвета субстратной см сен (*), регистрируемое фотометром.
Препараты антител к ШЕ и ОРАР из моноспецифических антисывороток получали с помощью иммуноаффинной хроматографии на иммуносорбентах (СИВг-сефароза СЬ4В с иммобилизованными высокоспецифичными ЫвЕ и ОРАР, соответственно).