Изменение аллостерической регуляции N-ацетилглутамат синтетазы и карбамоилфосфат синтетазы Escherichia coli методом комбинаторного мутагенеза

• Автор: Котлярова, Вероника Александровна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 103 с. : ил.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ
НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1 Л.Искусственная эволюция белков
1Л Л. Цели и задачи искусственной эволюции белков
1 Л.2. Искусственная эволюция белков методами случайного мутагенеза
1Л .2 Л. Радиационный и химический мутагенез
1Л .2.2. Метод подверженной ошибкам ПЦР
1.1.3. Искусственная эволюция белков методами направленного мутагенеза
1.1.3.1. Сайт-специфический мутагенез
1.1.3.2. Сайт-сосредоточенный мутагенез
1.1.3.3. Мутагенез рандомизированными олигонуклеотидами
1.1.4. Искусственная эволюция белков, основанная на рекомбинационных методах
мутагенеза
1.1.4.1 .Метод перетасовки ДНК
1.1.4.2. Метод геномной перетасовки
1.1.4.3. Метод прерывистой элонгации
1.1.4.4. Случайное образование химерных молекул на временной матрице
1.1.4.5. Гетеродуплекс
1.1.4.6. Сборка соответствующих олигонуклеотидов
1.1.4.7. Мутагенная и однонаправленная повторная сборка
1.1.4.8. Метод экзонной перетасовки
1.1.4.9. Негомологичная рекомбинация
1.2. Аллостерические ферменты
1.2.1. Аллостерическая регуляция
1.2.2. Ретроингибирование
1.2.3. ]Л-ацетилглутамат-синтетаза
1.2.4. Ы-ацетилглутамат киназа

1.2.5. Карбамоилфосфат синтетаза
1.2.5.1. Механизм действия CPSase
1.2.5.2. Аллостерическая регуляция CPSase
1.2.5.3. Регуляция транскрипции оперона сагАВ
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1.Бактериальные штаммы
2.1.1. Конструирование штамма B7::argA-ml3::argGH
2.2. Среды и условия культивирования штаммов
2.2.1. Условия культивирования штаммов TG1, В16-4, В3083 и В6969
2.2.2. Условия культивирования штаммов-продуцентов оротовой кислоты и аргинина
2.3. Эксперименты с рекомбинантной ДНК
2.3.1. Генно-инженерные методики
2.3.2. Конструирование плазмиды pUC18-argI
2.3.3. Конструирование плазмиды pKK-argA-wt
2.3.4. Конструирование плазмиды pMIV-5-Pi-argA-ml3
2.3.5. Конструирование плазмиды pM3V-5-Pj-argGH
2.3.6. Конструирование плазмиды pET-Piac
2.3.7. Конструирование плазмиды pEL-carAB-wt
2.3.8. Конструирование малокопийных плазмид, содержащих гены сагАВ
2.4. Создание библиотек мутантных генов
2.4.1. Создание библиотеки мутантных arg А генов
2.4.2. Создание библиотеки мутантных сагВ генов
2.5. Отбор активных мутантов
2.5.1. Отбор вариантов, синтезирующих активную NAGS в клетках E. coli штамма TG1
2.5.2. Отбор вариантов, синтезирующих активную NAGS в клетках E.coli В16
2.5.3. Отбор вариантов, синтезирующих активную CPSase
2.6. Выделение и очистка белка NAGS
2.7. Измерение ферментативных активностей
2.7.1. Анализ ферментативной активности мутантных NAGS
2.7.2. Анализ ферментативной активности мутантных CPSase

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
ЗЛ. Метод комбинаторного мутагенеза
3.2. Получение мутантов N-ацетилглутамат синтетазы
3.2.1. Конструирование рандомизированной библиотеки генов argA
3.2.2. Селекция “активных вариантов” мутантных ферментов NAGS в клетках E.coli штамма TG1
3.2.3. Селекция мутантных ферментов NAGS в клетках E.coli штамма В16
3.2.4. Активности мутантных ферментов в клеточных экстрактах
3.2.5. Очистка и кинетические свойства мутантных NAGS
3.2.6. Применение полученных fbr-мутантов NAGS в процессе создания штаммапродуцента аргинина
3.3. Применение метода комбинаторного мутагенеза для изменения
аллостерической регуляции карбамоилфосфат синтетазы из E. coli
3.3.1. Конструирование библиотеки мутантных генов сагВ
3.3.2. Селекция fbr мутантов CPSase
3.3.3. Применение полученных fbr-мутантов CPSase в процессе конструирования штамма-продуцента оротовой кислоты
3.3.4. Применение полученных fbr-мутантов CPSase в процессе конструирования
штамма-продуцента аргинина
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ