Щелочная фосфатаза термофильной бактерии Meiothermus ruber: клонирование гена и свойства рекомбинантного белка

• Автор: Юрченко, Юлия Валерьевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 98 с. : ил.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Щелочная фосфатаза микроорганизмов и высших организмов
1.1.1. Распространение и локализация
1.1.2. Структура щелочной фосфатазы
1.1.3. Механизм ферментативного действия
1.1.4. Свойства щелочной фосфатазы
1.1.5. Механизм регуляции экспрессии (на примере E. coli)
1.2. Ферменты термофильных микроорганизмов
1.2.1. Термофильные микроорганизмы
1.2.2. Физико-химические особенности ферментов термофильных 23 микроорганизмов
1.2.3. Термостабильные щелочные фосфатазы
1.3. Практическое применение щелочных фосфатаз
1.3.1. Использование щелочных фосфатаз для получения 33 ферментативных конъюгатов в методе ELISA
1.3.2. Применение щелочных фосфатаз в генной инженерии, 34 молекулярной биологии и диагностике
1.3.3. Использование щелочных фосфатаз в качестве репортерного 37 гена
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Культивирование штаммов микроорганизмов
2.2. Клонирование фрагмента гена щелочной фосфатазы М. ruber
2.3. Клонирование полноразмерного гена щелочной фосфатазы М
ruber
2.4. Конструирование плазмид для экспрессии гена щелочной 42 фосфатазы М. ruber в клетках E
2.5. Выделение и очистка рекомбинантных щелочных фосфатаз М
ruber
2.6. Определение активности щелочной фосфатазы М. ruber

2.7. Определение оптимума pH и температуры и термостабильности 48 щелочной фосфатазы М. ruber
2.8. Изучение влияния ионов металлов и химических агентов на 48 активность щелочной фосфатазы М. ruber
2.9. Определение субстратной специфичности щелочной фосфатазы 49 М. ruber
2.10. Дефосфорилирование 5’-концов ДНК
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Клонирование гена щелочной фосфатазы М. ruber
3.1.1. Клонирование ПЦР-фрагментов гена
3.1.2. Клонирование полноразмерного гена
3.2. Нуклеотидная последовательность гена щелочной фосфатазы М. 55 ruber
3.3. Сравнение аминокислотных последовательностей щелочной 59 фосфатазы М. ruber и других бактериальных щелочных фосфатаз
3.4. Биосинтез рекомбинантной щелочной фосфатазы М. ruber в 61 клетках E
3.5. Выделение и очистка рекомбинантной щелочной фосфатазы М. 67 ruber
3.6. Биохимические характеристики рекомбинантной щелочной 69 фосфатазы М. ruber
3.6.1. Влияние pH и температуры на активность щелочной 70 фосфатазы М. ruber, термостабильность фермента, субстратная специфичность и величина Кт для 4НФФ
3.6.2. Влияние ионов металлов на активность щелочной фосфатазы 74 М. ruber
3.6.3. Влияние химических агентов на активность щелочной 76 фосфатазы М. ruber
3.6.4. Дефосфорилирование 5’-концов ДНК с помощью щелочной 77 фосфатазы М. ruber
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ИПТГ изопропил-1 -THO-p-D-галактопиранозид
4НФФ 4-нитрофенилфосфат
ПААГ полиакриламидный гель
ПЦР полимеразная цепная реакция
ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота
п.н. пар нуклеотидов
т.п.н. тысяч пар нуклеотидов
BCIP 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат
CIAP щелочная фосфатаза из кишечника теленка (calf intestine alkaline
phosphatase)
ELISA иммуноферментный анализ, основанный на использовании
твердофазных носителей (enzyme linked immunosorbent assay) Fru-6-P D-фруктозо-б-фосфат
GST глутатион S-трансфераза (glutathione S-transferase)
PMSF фенилметансульфонилфторид
SDS додецилсульфат натрия

дефосфорилирования использовали препарат линеаризованной р11С19, не обработанный фосфатазой.