Получение генов амбер-супрессорных тРНК бактериофага Т5

• Автор: Трахтман, Наталия Викторовна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 121 с.

V СОДЕРЖАНИЕ
, СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ГЛАВА L ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общее строение молекул тРНК
1.2. Взаимодействие тРНК с аминоацил-тРНК-синтетазами
1.2.1. Нуклеотиды антикодона как элементы специфичности
1.2.2. Роль “дискриминаторного” основания во взаимодействии тРНК с соответствующей АРСазой
1.2.3. Другие элементы узнавания в молекуле тРНК
| 1.3. Супрессорные гены и супрессорные тРНК E. coli
1.4. Известные фагоспецифичные тРНК и их супрессоры

1.5. Факторы, влияющие на эффективность супрессии
1.5.1. Влияние последовательности мРНК, прилегающей
к нонсенс-кодону
1.5.2. Влияние структуры антикодоновой шпильки
1.5.3. Влияние модифицированных оснований в структуре тРНК
1.6. Использование супрессорных тРНК для определения элементов узнавания тРНК соответствующими АРСазами
1.7. биологическая роль фагоспецифичных тРНК
Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы
** 2.1.1. Бактериальные штаммы и плазмидные ДНК
2.1.2. Среды для выращивания E. coli
2.1.3. Буферы
2.1.4. Реактивы

2.1.5. Препараты ферментов
2.2. Методы исследования
2.2.1. Трансформация клеток E. coli плазмидной ДНК
2.2.2. Выделение плазмидной ДНК
2.2.3. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции
2.2.4. Электрофорез ДНК в агарозном геле
2.2.5. Введение нуклеотидных замен в гены тРНК с помощью двустадийной полимеразной цепной реакции (ПЦР)
2.2.6. Очистка фрагментов ПЦР с помощью электрофореза в ПААГ
2.2.7. Мечение 5'-конца олигонуклеотида с помощью полинуклеотидкиназы фага Т4
2.2.8. Метод отбора измененных генов тРНК
2.2.9. Определение нуклеотидной последовательности ДНК
2.2.10. Определение супрессорной активности
2.2.11. Определение изоформ щелочной фосфатазы
2.2.12. Выделение и очистка щелочной фосфатазы из клеток E. coli
2.2.13. Определение концентрации белка по Брэдфорду
2.2.14. Электрофорез белков в полиакриламидном геле
2.2.15. Определение промоторной активности
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Определение нуклеотидной последовательности области локализации генов тРНК бактериофага Т5
3.1.1 Анализ частоты использования кодонов в геноме бактериофага Т5
3.1.2. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей области генов тРНК бактериофагов Т5 и BF23 и фага
3.2. Конструирование генов амбер-супрессорных тРНК бактериофага Т5
3.3. Определение уровня супрессорной активности
3.3.1. Активность амбер-супрессоров в штамме E. coli ХАС

' 3.3.2. Определение влияния 5' - прилегающего к амбер-кодону триплета
на супрессорную активность
3.3.3. Отбор дополнительных мутаций, повышающих активность супрессорных тРНК

3.4. Определение аминокислотной специфичности амбер-супресорных тРНК 90 ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЯ
Приложение
БЛАГОДАРНОСТИ

минута; 25 циклов. На второй стадии ПЦР в смесь добавляли праймер 3 в количестве 25 пмолей, а также Год-полимеразу и продолжали реакцию в тех же условиях в течение еще 30-ти циклов. Температуру отжига праймеров рассчитывали с помощью программы “Ои§о”. Праймеры, использованные для мутагенеза, приведены в таблице 9.
Таблица 9. Олигонуклеотиды, использованные для получения генов амбер-супрессорных тРНК бактериофага Т5*.
Специфичность тРНК Олигонуклеотиды
А1а 1. 5 ’ -И^аайсОООСОААТАОТОТ-3 ’; 2. 5’-ТГСОТООАСАААСАОССАС-З’ М. 5АССАСАТТТАвАОТСТООТСТОСТ-З ’
Агй 1. 5 ’-ЦдааЦсСООСОТОТАОТСТААСС-З ’; 2. 5 ’ -ТТ ССССОАСОТ ИАСАввАТТ-3 ’ М. 5 ’-ОСАТАААСОААТТТТАСАСАСТССТСС-З ’
Азп М.5’-СААСССТСАААСТТТАСААОАТОССОСТС-3’
Авр 1. 5 ’ -й£ааЦсОССАССОООО-3 ’; 2. 5,-«ёёа1ссТООСОСОАСС-3’ М. 5 ’-СТСТССССТТАСАОСОСАСТАСС-З ’
Су8 1. 5’-й§ааЦсСОАССОГГСОСТ-3 ’; 2. 5 ’^аТссТОСАССАССОС-З ’ М. 5’-ААСОАТТТАСААТССТТССССТ-3’
ап 1. 5 ’-ЦвааЦсТССООАТТАССТТ-З ’; 2. б’^аЩсТООСАССООАТ-З’ М. 5^СТСОАСТТТАСАСЮССОААОС-3’
С1и 1. 5 ’ -Ц^аайсОТССТОТТАС АС АААСТ-3 ’; 2. 5 ’ -И^аЩсТОСССТССТвТ-3 ’ М. 5’-АСССТАССТТТАСАОООТАСТОАС-3’
«у М. 5 ’-АСТСАССОАСССТТТАСАООССТОСОАСАСА-З ’