Эффективная экспрессия в клетках Escherichia coli рекомбинантных генов цитокинов человека: делеционного варианта интерлейкина-4 (hil-4 δ2) и нейротрофина глиального происхождения (gdnf)

• Автор: Смирнов, Сергей Васильевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 102 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы
Цели и задачи работы
Научная новизна и практическая значимость работы
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Оптимизация экспрессии гетерологичных генов в клетках Escherichia coli
1.1 Основные компоненты экспрессионных векторов. Проблема стабилизация дозы рекомбинантного гена
1.2 Регуляция транскрипции
1.2.1. Промоторы
1.2.1.1. lac-промотор и его производные
1.2.1.2. рЕТ-векторы
1.2.1.3. Другие индуцируемые промоторы
1.2.2. Строго регулируемые экспрессионные системы
1.2.3. Терминаторы транскрипции
1.3 Регуляция трансляции
1.3.1. Инициация трансляции мРНК
1.3.2. Энхансеры трансляции мРНК
1.3.3. Стабильность мРНК
1.3.4. Элонгация трансляции
1.3.5. Точность трансляции
1.3.6. Терминация трансляции
2. Структурно-функциональные аспекты гетерологичной экспрессии белков в клетках
Escherichia coli
2.1. Цитоплазматическая продукция рекомбинантных белков
2.1.1. Формирование дисульфидных связей в цитоплазме E. coli
2.1.2 ПроцессингN-концевого метионинового остатка
2.2. Молекулярные шапероны
2.3. Секреция рекомбинантных белков
2.3.1 Периплазматическая продукция рекомбинантных белков
2.3.2 Экстраклеточная секреция рекомбинантных белков
2.5. “Слитые” белки
2.6. Деградация белков
2.7. Рефолдинг белков-продкутов гетерологичного синтеза
2.7.1. Выделение, очистка и солюбилизация телец включения
2.7.2. Ренатурация белка
мл ТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Бактериальные штаммы, плазмиды и среды
Эксперименты с ДНК
Конструирование рекомбинантного гена ИН-
Конструирование синтетического гена
Выделение и очистка белков
Приготовление препарата телец включения ЫЕ-
Ренатурация и очистка ЫЬ-
Ренатурация и очистка 1111,-4,
Определение биологической активности ЫЬ-
РЕЗУЛЬ ТА ТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Получение штаммов Escherichia coli-продуцентов делеционной формы интерлейкина-4 человека - hIL

1.1 Конструирование рекомбинантного гена ИИ-452 и его экспрессия в составе плазмиды риСТ1Ь-4б2.

1.2 Экспрессия гена ИП-452 в составе рекомбинантных плазмид рВТ1Ь-4б2 и рЕТ1Ь-4с12._
2. Ренатурации и очистка рекомбинантного МЬ-
3. Определение биологической активности препарата рекомбинантного МЬ-
4. Получение штаммов Escherichia coli - продуцентов нейротрофина глиального происхождения
4.1 Конструирование синтетического гена нейротрофина глиального происхождения человека - gdnf
4.2 Экспрессия синтетического гена gdnf в составе рекомбинантной плазмиды pBT-GDNF._
4.3 Экспрессия синтетического гена gdnf в составе рекомбинантных плазмид pBT-lacI-GDNF, placl-GDNF и placlQ-GDNF
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
2-МЕ — 2-меркаптоэтанол
сАМР - циклоаденозинмонофосфат (аденозин-3’,5’ - циклофосфат)
СопА — конканавалин А СбА — циклоспорин А
СТАВ — гексадецилтриметиламммоний бромид
ЭТЕ - дитиоэритритол (э/>мот/?о-2,3-дигидрокси-1,4-димер каптобутан)
ОТТ — дитиотреитол (тр>ео-2,3-дигидрокси-1,4-димеркаптобутан)
ОБОТ — нейротрофный фактор глиального происхождения Оп-НС1 - гуанидингидрохлорид
08 - глутатион (Ь-у-глутамил-Ь-цистеинилглицин)-восстановленная форма 0880 - глутатион (окисленная форма)
НЕРЕБ - ЇЧ-2-Гидроксиэтилпиперазин-1Ч’-2-этансульфоновая кислота
ІРТО (ИПТГ) - изопропил - р-Б-тиогалактопиранозид
ИЗБ - участок связывания рибосом
ЗОБ — додецилсульфат натрия
АТФ — аденозин 5’- трифосфат
ПААГ - полиакриламидный гель
ПЦР — полимеразная цепная реакция
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

клеток превышает 300 минут [Derman et al., 1993]. Однако, существуют супрессорные мутации, позволяющие клеткам trxB', gor'/gsh’ расти с приемлемой скоростью без добавления в культуральную среду восстанавливающих агентов. Дополнительный положительный эффект может быть достигнут, если в цитоплазме клеток такого штамма экспрессируется периплазматическая изомераза DsbC, у которой генно-инженерным способом делетировани сигнальный пептид [Bessette et al., 1999].
2.1.2 Процессинг N-концевого метионинового остатка.
Трансляция в E.coli инициируется образованием N-формилметионина,
который деформилируется в процессе синтеза белка [Adams, 1968], но не обязательно отщепляется. Часто добавочный метионин не оказывает эффекта на биологическую активность рекомбинантного белка, но в ряде случаев его присутствие драматически отражается на функции полипептида. Так, добавочный N-концевой Met изменяет конформацию гемоглобина человека [Kavanaugh et al., 1992] и полностью инактивирует цитокин RANTES [Proudfoot et al., 1996].
Отщепление N-концевого метионина осуществляется эндогенной метионин аминопептидазой [Ben-Bassat et al., 1987] и зависит от типа второго аминокислотного остатка в полипептидной цепи. Небольшие аминокислотные остатки, такие как Gly, Ala, Pro, Ser, Thr, Val, Cys, и в меньшей степени Asn, Asp, Leu и Ile способствуют отщеплению N-концевого метионина [Hirel et al., 1989]. Ко-экспрессия гена метионин аминопептидазы в E.coli также способствует удалению N-концевого метионина в рекомбинантных белках [Sandman et al., 1995]. Альтернативным подходом для получения идентичной N-концевой последовательности рекомбинантных белков является метод in vitro отщепления метионина с помощью экзопептидазы дипептидиламинопептидазы I. Этот фермент отщепляет дипептиды с N-конца белков, но не гидролизует пептидную связь, образованную с участием аминокислотного остатка пролина. Данный подход требует удлинения N-конца полипептида на четное число остатков и исключения возможности in vivo удаления N-концевого Met. Кроме того, второй или третий аминокислотный остаток в белке должен быть пролином [Dalboge et al., 1987].