Векторная система на основе генома аденовируса птиц CELO для доставки и экспрессии гена тимидинкиназы вируса простого герпеса человека типа 1

• Автор: Шашкова, Елена Викторовна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 121 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ.
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Векторные системы на основе геномов аденовирусов
1.1.1. Строение и экспрессия генома аденовируса человека типа 5..
1.1.2. Векторы на основе геномов аденовирусов человека
1.1.3. Особенности строения генома аденовируса птиц CELO в сравнении с геномом аденовируса человека типа
1.1.4. Особенности векторных систем на основе генома аденовируса птиц CELO
1.2. Экспрессия гена тимидинкиназы вируса простого герпеса человека типа 1 в составе геномов аденовирусных векторов
1.2.1. Функциональная активность HSV-tk
1.2.2. "Bystander" - эффект системы HSV-tk/GCV
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы
2.1.1. Вирусы и бактериальные штаммы
2.1.2. Клеточные линии
2.1.3. Плазмидные векторы
2.1.4. Ферменты и другие реактивы
2.1.5. Лабораторные животные
2.2. Методы
2.2.1. Выделение и очистка плазмидной ДНК
2.2.2. Выделение аналитических количеств плазмидной ДНК
2.2.3. Гидролиз ДНК специфическими эндодезоксирибонуклеазами
2.2.4. Лигирование фрагментов ДНК

2.2.5. Разделение фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле
2.2.6. Препаративное разделение фрагментов ДНК и элюция ДНК из геля
2.2.7. Трансформация клеток Е. coli
2.2.8. Идентификация рекомбинантных клонов
2.2.9. Трансфекция культур клеток методом кальциево-фосфатной преципитации
2.2.10. Котрансфекция клеток линии LMH для получения рекомбинантных аденовирусов CELO
2.2.11. Котрансфекция клеток линии 293 для получения рекомбинантных аденовирусов на основе генома Ад
2.2.12. Накопление вирусов
2.2.13. Очистка и концентрирование аденовирусов CELO
2.2.14. Выделение вирусной ДНК
2.2.15. Выделение ДЬЖ из клеток, инфицированных аденовирусами
2.2.16. Титрование вирусов
2.2.17. Дезоксиолигонуклеотиды и полимеразная цепная реакция
2.2.18. Количественное определение цитотоксичности в экспериментах in vitro
2.2.19. Определение функциональной активности CELO-TK in vivo
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Конструирование рекомбинантных аденовирусов CELO, экспрессирующих репортерный ген EGFP и терапевтический ген HSV-tk..
3.1.1. Конструирование челночного плазмидного вектора, несущего экспрессирующую кассету с геном HSV-tk в фрагменте генома Ад CELO.

3.1.2. Конструирование челночного плазмидного вектора, несущего экспрессирующую кассету с геном EGFP в фрагменте генома Ад CELO.
3.1.3. Изучение экспрессии гена HSV-tk в составе плазмидного вектора pCBEARV/TK при трансфекции культур клеток 293 и LMH
3.1.4. Получение рекомбинантных Ад CELO, несущих гены HSV-tk и EGFP в сайте делеции фрагмента генома, несущественного для репликации вируса CELO в культуре клеток LMH
3.2. Исследование функциональной активности рекомбинантного Ад CELO-ТК в экспериментах in vitro
3.2.1. Исследование цитотоксичности рекомбинантного вируса CELO-TK в культуре клеток А
3.2.2. Исследование способности Ад CELO-TK проявлять “bystander” эффект
3.2.3. Сравнение in vitro функциональной активности CELO-TK/GCV и Ad5-TK/GCV
3.2.3.1. Конструирование рекомбинантных вирусов Afl5-EGFP и Ад5-ТК на основе генома Ад5 человека
3.2.3.2. Сравнение in vitro цитотоксичности системы HSV-tk/GCV при использовании для доставки гена HSV-tk векторов на основе Ад CELO и Ад
3.3. Исследование функциональной активности вируса CELO-TK in vivo, в модели опухоли меланомы мышей В
3.3.1. In vivo трансдукция векторной системой на основе генома Ад CELO подкожных опухолей меланомы мышей В
3.3.2. Влияние внутриопухолевых инъекций рекомбинантного Ад CELO-TK на рост опухолей меланомы В
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

вирусом простого герпеса, ингибируется воздействием АСУ или GCV, опосредованным продуктами фосфорилирования HSV-tk нуклеозидных аналогов. GCV является более эффективным ингибитором по сравнению с АСУ, а также нуклеозидными аналогами пиримидинового ряда (Balsarini J. et. al., 1993; Degreve В.et. al., 1999).
Развитие цитотоксического эффекта системы HSV-tk/GCV происходит в несколько этапов, начиная с образования GCV-монофосфата. Аффинность клеточных тимидинкиназ к GCV в 1000 раз ниже аффинности HSV-tk, поэтому GCV преимущественно фосфорилируется вирусной тимидинкиназой (Keller P.M. et al., 1981). Было показано, что образующиеся монофосфаты далее фосфорилируются с помощью эндогенных киназ в трифосфаты, которые встраиваются в ДНК при ее синтезе (Matthews Т., and Boehme R., 1988). Это приводит к ингибированию ДНК-полимеразы и прекращению дальнейшего синтеза ДНК (Ilsley D.D. et al., 1995), в результате чего активируется механизм программируемой клеточной смерти - апоптоз (Hamel W. et al., 1996; Wallace H. et. al., 1996). Таким образом, клетки, экспрессирующие ген тимидинкиназы вируса простого герпеса, приобретают чувствительность к нуклеозидным аналогам и проявляемой ими цитотоксичности.
Способность HSV-tk вызывать апоптоз в присутствии GCV используется для изучения и в клинических испытаниях терапии злокачественных опухолей (Anderson L.M. et al., 1999; Minemura K. et al., 2000; Todryk S. et al., 2001). В качестве средства доставки гена HSV-tk в клетки опухоли широко используют Ад векторы (рис. 3). В присутствии GCV в результате образования токсичных фосфатов и их распространения в опухоли достигается терапевтический эффект. Поскольку мишенями такой системы могут быть только делящиеся клетки, специфичность к опухолевым