Особенности генетической изменчивости вируса Эбола в процессе адаптации к морским свинкам

• Автор: Субботина, Екатерина Леонидовна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 161 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Семейство Filoviridae: общие сведения и классификация
1.2 Клиническая и патогенетическая характер истика геморрагической лихорадки
Эбола
1.3 Строение генома вируса Эбола
1.4 Генетическое разнообразие, происхождение и эволюция вируса Эбола
1.5 Структура вириона и свойства белков вируса Эбола
1.6 Эпидемиологическая характеристика геморрагической лихорадки Эбола.
Природные резервуары и переносчики
1.7 Инфекция Эбола у лабораторных животных и получение адаптированных
штаммов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Материалы
2.2 Методы
2.2.1 Определение биологического титра и клонирование вируса Эбола
2.2.2 Пассажи вируса Эбола на морских свинках
2.2.3 Гематологические тесты
2.2.4 Оценка фагоцитоза нейтрофиламн крови
2.2.5 Статистическая обработка данных
2.2.6 Выделение суммарной РНК
2.2.7 Проведение реакции РНК-лигирования
2.2.8 Проведение реакции обратной транскрипции
2.2.9 Амплификация фрагментов генома вируса Эбола методом ПЦР
2.2.10 Определение содержания геномной РНК вируса Эбола в культуральной жидкости методом двухраундовой ОТ-ПЦР
2.2.11 Очистка продуктов амплификации после проведения ПЦР
2.2.12 Определение последовательности нуклеотидных остатков ДНК
2.2.13 Компьютерный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖД ЕНИЕ
3.1 Адаптация вируса Эбола к морским свинкам
3.1.1 Клонирование вируса Эбола
3.1.2 Пассажи клона вируса Эбола на морских свинках

3.2 Генетический анализ клона вируса Эбола preGPA-cIone и варианта GPA-P7
3.2.1 Расчет олигонуклеотидных праймеров для амплификации и определения полноразмерных последовательностей генома вируса Эбола
3.2.2 Генетический анализ клона вируса Эбола preGPA-clone
3.2.2.1 Определение полной последовательности н.о. геномной РЕК клона-предшественника адаптированного к морским свинкам вируса Эбола (preGPA-clone)
3.2.2.2 Анализ нуклеотидной последовательности генома клона preGPA-clone
3.2.2.3 Анализ аминокислотных последовательностей белков клона preGPA-clone
3.2.3 Генетический анализ адаптированного к морским свинкам варианта вируса
Эбола GPA-P7
3.2.3.1 Определение полной последовательности н.о. геномной РНК адаптированного к морским свинкам варианта вируса Эбола (GPA-P7)
3.2.3.2 Анализ нуклеотидной последовательности генома варианта GPA-P7
3.2.3.3 Анализ аминокислотных последовательностей белков варианта GPA-P7
3.3 Анализ генетической изменчивости вируса Эбола в процессе адаптации к
морским свинкам
4 ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
GP - (Glycoprotein) - гликопротеин
ICEBOV (ВЭ-Берег Слоновой Кости) - Ivory-Coast ebolavirus
МНС - major histocompatibility complex - главный комплекс гистосовместимости
NP - (Nucleoprotein) - нуклеопротеин
REBOV (ВЭ-Рестон) - Reston ebolavirus
SEBOV (ВЭ-Судан) - Sudan ebolavirus
TLR - Toll-like receptors
TREMs - Triggering Receptors Expressed on Myeloid cells
VP - (Viral protein) - вирусный белок
ZEBOV (ВЭ-Заир) - Zaire ebolavirus
A.o. - аминокислотный остаток
АПК - антигенпрезентругощая клетка
АТФ - аденозин трифосфат
БОЕ - бляшкообразующая единица
ВИЧ - вирус иммунодефицита человека
ВМ - вирус Марбург
ВОЗ - всемирная организация здравоохранения
ВПЧ - вирусоподобная частица
вРНК - вирусная геномная РЕПС
ВЭ - вирус Эбола
ДК - дендритные клетки
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
дНТФ - дезоксинуклеозид-5’-трифосфаты
ДРК - Демократическая Республика Конго
Е.а. - единица активности
ИД50 - 50% инфицирующая доза
ИЛ - интерлейкин
ИФН - интерферон
кДНК - ДНК-копия, комплементарная РНК
мРНК - матричная РНК
Н.о. - нуклеотидный остаток
ОТ - обратная транскрипция
П.и. - после инфицирования
П ,н. - пар нуклеотидных остатков
ПФС - показатель фагоцитарной способности
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РНК - рибонуклеиновая кислота
РНП-комплекс - рибонуклеопротеиновый комплекс
СМФ - система мононуклеарных фагоцитов
Т.н.о. — тысячи нуклеотидных остатков
ФНО - фактор некроза опухолей
ЭДТА - этилендиаминтетраацетат
основных аминокислотных остатков, потенциальные центры связывания АТФ, два близко расположенных остатка цистеина в С-концевом районе белка, а также локализация генов, кодирующих эти белки (Takada A. et al., 2000, Theriault S. et al., 2004).
РНК-зависимые РНК-полимеразы вирусов с негативным РНК-геномом в комплексе с соответствующими белками, осуществляют не только процессы репликации, транскрипции и полиаденилнрования, но, по-видимому, и кепирования вирусных мРНК. Фактическое расположение активных центров не выяснено, однако компьютерный анализ позволяет выявить расположение гипотетических активных центров, в силу их высокой консервативности.
Наиболее консервативной областью является N-концевая часть белка L, в которой было выявлено три высоко консервативных домена: А, В и С. Первый блок (позиции 553-571 а.о. для ВЭ), по-видимому, включает РНК-связывающий элемент. Высоко консервативный пептидный мотив GDNQ, расположенный на С-конце В-домена (позиции 744-747 а.о. для ВМ и 553-571 а.о. для ВЭ), фланкированный остатками гидрофобных аминокислот, предположительно связан с ферментативной активностью РНК-зависимой РНК-полимеразы, а С-блок - является АТФ- или пуринтрифосфат-связывающим доменом Установлено, что мутации в GDNQ-домене полностью блокируют ферментативную активность белка L (Feldmann Н. и Kiley М. Р. 1999).
Генетические исследования показали, что РНК-зависимая РНК-полимераза вируса визикулярного стоматита, представителя порядка Mononegavirales, имеет метилтрансферазную активность и принимает участие в кепировании вирусных мРНК на стадии метилирования первого нуклеотида по 2’-положению (Hercyk N. et al., 1988). Дальнейшие поиски по базам данных аминокислотных последовательностей выявили наличие шести консервативных мотивов в С-концевом районе последовательности белков L представителей порядка Mononegavirales. Это район (для ВЭ 1803-1937 а.о.) предположительно образует консервативную вторичную структуру, состоящую из