Пуринергическая сигнальная система вкусовых клеток

• Автор: Барышников, Сергей Геннадиевич
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 91 с. : ил.

1. Введение
2. Литературный обзор
2.1 Вкусовые клетки млекопитающих
2.2 Сигнальные каскады вкусовых клеток
2.3 Межклеточные коммуникации и
сигнальные молекулы вкусовой почки
2.4 Пуринорецепторы и сопряжённые с ними сигнальные каскады
2.5 Кальциевая сигнализация
3. Материалы и методы
3.1 Выделение вкусовых клеток и их подготовка к эксперименту
3.2 Метод микрофотометрии и экспериментальная установка
4. Результаты и обсуждение
4.1 Феноменология действия АТР
4.2 Активация фосфолипазы С и 1Рз рецепторов под действием АТР
4.3 Вклад SOC каналов в АТР-ответы
4.4 Механизмы удаления Са2+ из цитоплазмы
4.5 Модуляция сАМР и фосфорилированием
4.6 Моделирование динамики Са2+ сигналов во вкусовых клетках в
ответ на АТР
5. Заключение
6. Выводы
7. Список литературы
8. Список сокращений

1. Введение.
Сенсорные системы обеспечивают организмы информацией об окружающем мире, которая жизненно важна для их существования. Основной функцией вкусовой системы является оценка качества пищи. Так вещества, имеющие сладкий (т.е., привлекательный) вкус, являются высококалорийными, а большинство горьких веществ являются ядовитыми. Считается, что человек способен различать пять базовых вкуса: кислый, соленый, сладкий, горький и умами (итапп), который вызывается глютаматом и некоторыми другими аминокислотами. Поведенческие эксперименты, а также регистрации активности вкусовых нервных волокон дают основания полагать, что данные вкусовые модальности скорее всего применимы к животному миру в целом. Это предполагает существование молекулярных структур на рецептирующей поверхности вкусовых клеток, которые специализируются в распозновании вкусового стимула соответствующей модальности. Достижения последних лет молекулярной биологии вкуса свидетельствуют о том, что это действительно так. В частности, идентифицированы мембранные рецепторы для сладких и горьких веществ и аминокислот, вызывающих умами вкус. Тем не менее, молекулярные механизмы вкуса во многом не ясны, поскольку во вкусовой клетке ни для одного из вкусовых стимулов не прослежена вся последовательность событий от взаимодействия с молекулярным рецептором до выброса нейромедиатора.
Одной из задач физиологии вкусового органа, которую предстоит решить, является исследование межклеточных коммуникаций во вкусовой почке. Популяция вкусовых клеток гетерогенна. Во вкусовой почке идентифицировано три морфологически различных типа веретенообразных клеток, функциональная роль которых доподлинно неизвестна, но которые, по-видимому, выполняют рецепторную, поддерживающую и/или
секреторную функции. Эти клетки обмениваются примерно раз в двадцать дней, развиваясь из клеток предшественников и в конце жизни подвергаясь апоптозу. Поскольку вкусовые клетки устанавливают афферентные синапсы с вкусовыми нервами, то их непрерывное обновление требует постоянного установления новых синаптических связей во вкусовой почке. Кроме того, подобно тому, как это происходит в сетчатке или обонятельной луковице, сенсорная информация также может подвергается первичной обработке во вкусовой почке. Протекание всех этих гетерогенных но синхронизированных процессов несомненно требует хорошо отлаженных коммуникаций между клетками вкусовой почки. Ряд фактов, установленных в последние годы, свидетельствуют в пользу подобной точки зрения. В частности, присутствие сигнальных молекул нескольких типов (ацетилхолин, ГАМК, субстанция Р) во вкусовой почке было показано иммуногистохимически, в то время как рецепторы к ним были найдены во вкусовых клетках методами молекулярной биологии и электрофизиологии.
Недавно нами было установлено, что экстраклеточный АТР мобилизует Са2+ в цитоплазме вкусовых клеток. Фармакология эффектов АТР не оставляет сомнения в том, что действие нуклеотида опосредуется метаботропными рецепторами P2Y типа. Эти и другие наблюдения свидетельствуют о том, что АТР может быть еще одной сигнальной молекулой, обеспечивающией коммуникации между вкусовыми клетками. Поэтому основной целью данной работы было изучить механизмы генерации внутриклеточных Са2+ сигналов во вкусовых клетках в ответ на АТР и очертить возможную роль пуринэргической сигнальной системы в функционировании органа вкуса.

Са2+ в контроле была поднята до 5 мМ. Использовалась классическая схема активации SOC каналов. Внутриклеточные Са2+ депо опустошались с помощью ингибитора ретикулярной ATP-азы тапсигаргина (1 рМ) в присутствии 100 нМ экстраклеточного Са2+ (Рис.9А). После 10-15 минут инкубации концентрация внешнего Са2+ опять поднималась до 5 мМ, что индуцировало быстрое увеличение концентрации внутриклеточного Са2+, ингибируемое ионами Gd3+, на 100 - 200 %, по сравнению с контролем (Рис.9А). Таким образом, в результате опустошения Са2+ депо существенно увеличилась Са2+ проницаемость наружной мембраны клетки, что является обычным доказательством присутствия SOC каналов на мембране клетки. Аналогичные эксперименты были проведены в условиях, когда Са2+ депо опустошалось внеклеточным АТР в растворе с пониженным Са2+ (100 нМ) (Рис.9Б). Увеличение Са2+ проницаемости плазматической мембраны в этом случае было меньше чем в эксперименте с тапсигаргином, однако , по полученным данным можно утверждать, что АТР индуцирует вход внеклеточного Са2+ во вкусовых клетках, который также блокируется ионами Gd3+. Действие же Gd3+ на АТР - ответ в целом приводит к частичному блокированию как плато так и пика (Рис 9В). Эти данные согласуются с экспериментами в бекальциевой среде, в которых амплитуда Са2+ ответа всегда меньше чем в нормальных условиях. На основании выше сказанного можно утверждать, что активация SOC каналов происходит синхронно с опустошением Са2+ депо и по нашим оценкам, амплитуда АТР - ответа на 20 - 30 % определяется входом экстраклеточного Са2+.