Создание и изучение ДНК-стабилизированных люминесцирующих кластеров серебра

• Автор: Волков, Иван Леонидович
• Шифр специальности: 02.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 134 с. : ил.

Оглавление
Введение
Глава 1. Современные представления о свойствах нанокластеров металлов
1.1. Классификация металлических частиц и их основные свойства
1.2. Кластеры в водных растворах. Полимер-стабилизированные кластеры
1.3. ДНК-стабилизированные кластеры серебра
Глава 2. Методы исследования и используемые материалы
2.1. Измерение флуоресценции
2.2. Нелинейная флуоресцентная спектроскопия насыщения
2.3. Микроскопия
2.4. Другие методы исследования
2.5. Подготовка систем для исследования
2.6. Синтез ДНК-стабилизированных кластеров серебра
Глава 3. Кластеры серебра, синтезированные на тимусной ДНК
3.1. Стационарная люминесценция кластеров
3.2. Характеристика систем методами электронной микроскопии
3.3. Фотофизические параметры возбужденных состояний ДНК-стабилизированных кластеров
3.4. Исследование систем методами спектроскопии поглощения, кругового дихроизма, вискозиметрии и гель-электрофореза
Глава 4. ДНК-полимерная глобула, включающая флуоресцирующие кластеры серебра
Заключение
Список литературы
Введение
Актуальность темы исследования. Нанокластеры металлов, содержащие до нескольких десятков атомов, представляют особый класс нанообъектов. При столь малых размерах существенный вклад в их электронные свойства вносят квантоворазмерные эффекты, благодаря чему их электронно-энергетическая структура становится подобна молекулярной. Особенный интерес представляют кластеры благородных металлов (золота, серебра), которые показывают хорошую способность к люминесценции. Кластеры серебра, первоначально синтезированные в твердых матрицах, показали свою перспективность в качестве люминофоров. Использование таких структур в качестве люминесцирующих биометок требует создания устойчивых в водных растворах систем. Для этого были разработаны методики получения полимер-стабилизированных кластеров с использованием синтетических и биологических полимеров [1].
Особый интерес представляют ДНК-стабилизированные люминесцирующие кластеры серебра. Благодаря высокому сечению поглощения и значительному квантовому выходу, а также хорошей биосовместимости и фотостабильности [1], такие кластеры считаются перспективными для использования в качестве молекулярных сенсоров и зондов для биомиджинга [2]. Согласно литературным данным, уникальным свойством ДНК-стабилизированных кластеров является вариация длины волны испускания кластера в зависимости от последовательности азотистых оснований в ДНК-матрице, на которой синтезируется кластер [3]. Изменение люминесценции при взаимодействии таких структур с другими молекулами ДНК могут стать основой для создания принципиально новых флуоресцентных зондов. Хотя исследования в этой области ведутся интенсивно на протяжении около 10 лет и накоплено большое количество эмпирических данных, структура комплекса ДНК-кластер до сих пор неизвестна.

Наличие долгоживущего возбужденного темнового состояния и возможность модулирования его заселенности дополнительной длинноволновой засветкой делает кластеры перспективными объектами для микроскопии сверхвысокого разрешения и методик синхронного детектирования [4]. Однако данные о фотофизических параметрах возбужденных состояний были получены ранее только для кластеров одной спектральной группы, излучающих в красном диапазоне видимого света, поэтому более подробное изучение этих свойств представляется актуальным.
Использование кластеров в качестве флуоресцентных меток для клеточных исследований подразумевает наличие способов их эффективной транспортировки через клеточную мембрану. Несмотря на наличие некоторых успешных примеров в этой области, они не лишены недостатков, поэтому разработка новых способов доставки флуорофоров в клетку все еще остается актуальной задачей. Благодаря уникальным физико-химическим свойствам, молекула ДНК предоставляет широкие возможности для создания наноразмерных структур. Так, например, комплексы высокомолекулярной ДНК с синтетическими поликатионами являются широко изученными системами для создания генных векторов. Включение в такую ДНК-полимерную глобулу флуоресцирующих структур представляется перспективным методом упаковки кластеров для транспортировки внутрь клетки. Такие структуры могут выгодно отличаться от полупроводниковых квантовых точек, имеющих больший размер и высокую токсичность.
Целью работы является создание и изучение свойств люминесцирующих ДНК-стабилизированных нанокластеров серебра и создание на их основе компактных люминесцирующих ДНК-полимерных наночастиц.
В связи с этим в диссертации решаются следующие задачи:
1. Подбор оптимальных условий для синтеза люминесцирующих кластеров серебра, стабилизированных высокомолекулярной ДНК и изучение их спектральных свойств.

Рис. 1.20. Применение метода восстановления синхронно усиленного флуоресцентного изображения для ДНК-стабилизированных кластеров серебра. Слева: модуляция интенсивности люминесценции кластеров с помощью длинноволнового возбуждения. Возбуждение люминесценции производится постоянным лазером 633 нм, второй импульсный лазер (10Гц) 805 нм выводит кластеры из темнового состояния, существенно увеличивая светимость образца (А, В). Справа: пример окраски клетки кластерами серебра. На образец также нанесен краситель СуЗ, моделирующий сильный люминесцентный фон. Метод восстановления синхронно усиленного флуоресцентного изображения позволяет значительно повысить соотношение сигнал/шум изображения. Показан интегральный сигнал люминесценции (С) и сигнал, зарегистрированный на частоте модуляции (D) [61].
является простота реализации, однако существенным ограничением является слабая растворимость серебра в биологических солесодержащих буферах. Одним из подходов оптимизации трансфера кластеров, синтезированных in vitro, является их сопряжение со специальным агентом доставки, который облегчает их проникновение