Нелинейно-оптические эффекты и многофотонное поглощение фемтосекундных импульсов в микрохирургии ранних эмбрионов млекопитающих

• Автор: Залесский, Александр Дмитриевич
• Шифр специальности: 01.04.17
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 112 с. : ил.

Содержание
1. Введение
2. Глава 1. Литературный обзор
3. 1.1 Лазерный оптический «пинцет»
4. 1.1.1 Принцип действия оптического манипулятора
5. 1.1.2 Обзор применений методики оптического «пинцета»
6. 1.1,3 Новые возможности оптического манипулирования -голографический оптический «пинцет»
7. 1.2 Фемтосекундный лазерный скальпель для биологических объектов
8. 1.2.1 Классификация механизмов воздействия лазерного излучения на биологические объекты
9. 1.2.2. Примеры экспериментального использования фемтосекундного лазерного скальпеля
10. 1.3 Возможность использования лазерных технологий в клеточной инженерии
11. Глава 2. Реализация экспериментальных методик: фемтосекундный «манипулятор-скальпель» и глографический «манипулятор-скальпель» с использованием фемтосекундного и непрерывных лазеров
12. 2.1 Экспериментальная установка фемтосекундного«манипулятора-скальпеля»
13. 2.2 Экспериментальная установка голографического «манипулятора-скальпеля» с использованием фемтосекундного и непрерывных лазеров
14. Глава 3. Теоретическое рассмотрение фемтосекундного оптического пинцета и голографического манипулятора
15. 3.1 Оптический захват и манипулирование мезоскопической частицей фемтосекундным лазером
16. 3.1.1 Движения частицы в потенциальной яме под действием света
17. 3.1.2 Эффект движения потенциальной ямы
18. 3.2 Отражение фемтосекундного лазерного импульса от пространственного оптического модулятора
19. 3.2.1 Метод вычислений
20. 3.2.2 Результаты вычислений
21. Глава 4. Экспериментальные результаты по оптическому манипулированию и лазерной микрохирургии
22. 4.1 Микрохирургическое воздействие фемтосекундным «скальпелем»
23. 4.1.1 Воздействие на скопление раковых эпителиальных клеток
24. 4.1.2 Эксперименты с единичным нейроном и нервным волокном
25. 4.1.3 Фемтосекундная оптоперфорация стенки цианобактерии АпаЬаепа эр. РСС 7120 в присутствии наночастиц золота

26. 4.1.4 Воздействие на метафазную пластинку ооцита мьтттти-фемтосекундная энуклиация
27. 4.1.5 Слияние бластомеров в двухклеточном эмбрионе фемтосекундным «скальпелем»
28. 4.2 Оптический захват и манипулирование при помощи фемтосекундного и непрерывного лазера
29. 4.2.1 Оптическое манипулирование единичной клеткой
30. 4.2.2 Манипуляции единичным нервным волокном
31. 4.2.3 Манипулирование многими объектами одновременно
32. 4.2.4 Одновременное использование фемтосекудного «скальпеля» и оптического манипулирования непрерывным лазером
33. 4.3 Микрохирургия при помощи диодного лазера
34. Глава 5. Технология получения «чистых линий» генетически модифицированных животных и неинвазивного лазерного терапевтического клонирования
35. 5.1 Технология получения химерных животных и «чистых линий» животных
36. 5.1.1 Получение «чистой линии» из двухклеточного (двухбластомерного) эмбриона
37. 5.1.2 Получение «химеры» из доимплантного эмбриона
38. 5.2 Неинвазивная методика фемтосекундного лазерного терапевтического клонирования
39. Заключение
40. Список литературы

Введение.
Диссертационная работа посвящена экспериментальному и теоретическому изучению взаимодействия лазерного излучения с искусственными и биологическими мезоскопическими объектами. Основной задачей работы является исследование взаимодействия остросфокусированных лазерных пучков с эмбриональными клетками и разработка экспериментальных методик. Актуальность работы определяется фундаментальным интересом к механизмам взаимодействия сверхкоротких лазерных (фемтосекундных) импульсов с биологическими объектами, что связано с развитием новых клеточных биотехнологий.
Со стороны остро сфокусированного лазерного пучка в условиях значительного градиента интенсивности светового поля на мезоскопический объект размером от десятком нанометров до сотен микрон действуют силы, втягивающие объект в область перетяжки пучка. Сфокусированный лазерный пучок способен захватить мезоскопический объект в так называемую оптическую ловушку. С помощью оптической ловушки можно осуществлять манипулирование объектом в пространстве, т.е. оптическая ловушка выполняет функцию лазерного пинцета[1]. Лазерные пинцеты с использованием непрерывных или наносекундных импульсных лазеров с высокой частотой следования импульсов нашли широкое применение в работе с мезоскопическими биологическими объектами. Сегодня этот метод уже находит множество применений: перемещение золотых наночастиц размером больше 10 нм [2]; измерение потоков жидкости в микроскопических объектах [3]; сортировка клеток, бактерий [4]; измерение сил адгезии между двумя клетками[5]; создание сложных трёхмерных биологических структур[6]; разработка направленной доставки и прицельного воздействия на биологические мишени; измерение силы, необходимой для разрыва двойной спирали ДНК[7]; манипулирование отдельными органеллами внутри живой клетки [8]. В диссертационной
инактивация генома ооцитов или зигот с целью получения реципиентных цитопластов для последующего введения донорских ядер. Процесс энуклеации обычно осуществляется традиционным методом механического микрохирургического удаления хромосомной пластинки из ооцита. Несмотря на высокую степень лабильности эмбриональных клеток, такие приемы являются в серьезной степени травмирующими. Варианты механической энуклеации были использованы во многих работах. [62, 68, 69].
Относительно недавно стали также использовать химическую энуклеацию [70-72]. Кроме того, стандартные механические методы энуклеации предполагают обязательное использование цитохалазина. В для повышения пластичности клетки, который вызывает значительные изменения цитоскелета особенно воздействуя на актиновые филаменты [73, 74]. На сегодняшний день эффективность клонирования остается весьма низкой, в том числе из-за этапа энуклеации, поскольку механическое извлечение ядра неизбежно связано с уменьшением объема цитопласта и, вероятно, вследствие этого со снижением его репрограммирующей способности, а при химической энуклеации ооциты или зиготы подвергаются воздействию токсических веществ, что также может приводить к снижению их жизнеспособности.
Интенсивное развитие лазерных технологий и биофотонной инженерии способствовало широкому использованию этих методов в биологических исследованиях, в том числе в клеточной биологии. Возможность использования лазерных технологий в клеточной биологии и биологии развития принципиально была показана еще несколько десятилетий назад [9]. Интересно отметить, что одно из первых исследований по лазерной микрохирургии на отдельной клетке было проведено на ранних эмбрионах млекопитающих, предимплантационных эмбрионах кролика [9], но эта микрохирургия заключалась только в разрушении отдельных бластомеров. В настоящее время лазерные методы достаточно интенсивно используется в