Экспрессия генов раннего ответа и генов каспаз как возможный диагностический маркер при развитии рака шейки матки

• Автор: Курмышкина, Ольга Вадимовна
• Шифр специальности: 14.01.12, 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Петрозаводск
• Количество страниц: 151 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Гены раннего ответа и каспазы как компоненты молекулярно-генетического
«портрета» РШМ
Г1. Геном ВИЧ и механизмы злокачественной трансформации
1.2. Молекулярно-генетический профиль ЦИН и РШМ: современные
представления
1.3. Гены раннего ответа и каспазы - регуляторы ключевых программ клетки
1.4. Взаимодействие ВПЧ-онкогенов и генов раннего ответа при развитии РШМ
1.5. Действие онкогенов ВОТ на механизм каспаз-зависимого апоптоза
2. Иммунный ответ организма при индукции и прогрессии РШМ
2.1. Механизмы ВПЧ-индуцированной иммуносупрессии
2.2. Локальные и системные нарушения показателей клеточного иммунитета при хронической ВИЧ-инфекции и развитии интраэпителиальных неоплазий
шейки матки
2.3. Индукция апоптоза иммунокомпетентных клеток как фактор прогрессии

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Характеристика пациентов и методов получения биоматериала
2. Описание молекулярно-генетических и иммунологических методов исследования
2.1. ВПЧ-титтирование
2.2. Проведение полимеразной цепной реакции в «режиме реального времени»
(ПЦР-РВ)
2.3. Анализ экспрессии белков с-Мус, с-Гоб и сДип методом Уе51ет-блоттинг
2.4. Определение активности каспаз
2.5. Иммунофенотилирование МНПК
2.6. Определение характера повреждений ДНК

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Экспрессия генов раннего ответа в ткани при ЦИН 3 и РШМ
1.1. Определение относительного содержания мРНК методом ПЦР-РВ
1.2. Определение содержания белков c-Fos, с-Мус, c-Jun (Westem-блоттинг)
2. Экспрессия генов каспаз -3, -6 и -9 в ткани при ЦИН 3 и РШМ
2.1. Определение относительного содержания мРНК методом ПЦР-РВ
2.2. Определение протеолитической активности
3. Дестабилизация ДНК при развитии РШМ
4. Иммунофенотипирование МНПК больных ЦИН 3 и РШМ
5. Экспрессия каспаз в МНПК больных ЦИН 3 и РШМ
6. Влияние иммуномодулирующей терапии на показатели клеточного иммунитета больных ЦИН 3 и микроинвазивным РШМ
7. Экспрессия каспаз в МНПК больных ЦИН 3 и РШМ LA стадии после курса
терапии Аллокином-альфа
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
1. Экспрессия генов раннего ответа при развит™ РШМ
1.1. Экспрессия генов c-fos и c-jun
1.2. Экспрессия с-тус
2. Экспрессия генов каспаз при развитии РШМ
3. Изменения иммунного статуса при развитии РШМ
3 .1. Показатели клеточного иммунитета при развитии РШМ. Влияние
иммуномодулирующей терапии
3.2. Показатели активности апоптоза в МНПК при развитии РШМ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
Список сокращений и условных обозначений
Список литературы
Приложение

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы исследования. Несмотря на значительные успехи современной медицины в разработке методов профилактики, ранней диагностики и терапии злокачественных новообразований, рак шейки матки (РШМ) по-прежнему остается одной из главных причин смертности женщин от онкологических заболеваний. Согласно статистическим отчетам Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), каждый год РШМ диагностируется более чем у 500 тыс. женщин (в России - более чем у 14 тыс.) [4]. В подавляющем большинстве случаев (99%) развитие РШМ ассоциировано с хронической папилломавирусной инфекцией [77]. В течение двух последних десятилетий в России отмечается существенный прирост показателей инфицированности населения вирусом папилломы человека (ВГТЧ) и числа заболевших РШМ, особенно среди женщин моложе 45 лет [4]. Развитие скрининговых программ способствует снижению смертности от РШМ, в первую очередь, за счет увеличения частоты выявления ранних, доклинических форм рака и дисплазий, которые легко устраняются стандартными хирургическими методами. Однако используемые подходы недостаточно эффективны, и причины сложившейся ситуации связаны не только с уровнем организации медицинской помощи, профилактических мероприятий или социально-экономическими факторами, но и с несовершенством методов диагностики. Применяемые сегодня в клинической практике критерии диагностики РШМ имеют ряд ограничений в отношении точности постановки диагноза, возможности прогнозирования течения заболевания и не позволяют учитывать индивидуальный статус пациентки. Для преодоления этих недостатков необходимы разработка и внедрение новых методов молекулярно-генетической и биохимической диагностики, основанной на анализе экспрессии тканевых биомаркеров, качественный и количественный состав которых изменяется в процессе развития заболевания [3]. Поэтому поиск и верификация биомаркеров РШМ, имеющих предиктивное и прогностическое значение, является одной из наиболее актуальных проблем онкогинекологии. Такой спектр биомаркеров будет в особенности востребован при диагностике наиболее ранних цервикальных заболеваний - дисплазий эпителия шейки матки, карциномы in situ и микроинвазивного РШМ.

- NKT клеткам (Natural Killer T cells). Активация NKT клеток приводит к быстрой секреции цитокинов IL-4, IL-13, IFNy, стимулирующих реакции клеточного и гуморального иммунитета. Учитывая, что несколько ранее было установлено изменение профиля гликолипидов, представляющих тканеспецифичные антигены групп АВН и Lewis, на поверхности эпителиальных клеток по мере прогрессии ЦИН и РШМ [122], можно предположить, что данный механизм играет существенную роль в ингибировании активности NKT клеток и создании невоспалительного микроокружения.
Несмотря на то, что по мере прогрессии неоплазии в очаге патологии все-таки происходит заметное увеличение количества инфильтрирующих ЦТЛ, натуральных киллеров и макрофагов, предполагают, что эти эффекторные клетки приобретают толерантность, становятся энергичными по причине того, что иммунный ответ долгое время развивается в невоспалительной среде [172].
2.2. Локальные и системные нарушения показателей клеточного иммунитета при хронической ВПЧ-инфекции и развитии интраэпителиальных неоплозий шейки матки
ВПЧ-специфический CD4(+)Thl-клеточный ответ, вероятно, играет первостепенную роль в клиренсе ВПЧ. Предположительно, именно нарушение CD4(+)-ответа способствует установлению персистирующей ВПЧ-инфекции, а затем прогрессии дисплазии. Это подтверждается тем фактом, что у пациенток с прогрессирующей дисплазией шейки матки существенно подавлен именно этот тип иммунного ответа. Также косвенным доказательством главенствующей роли Т-хелперов в защите от ВПЧ-инфекции является высокая частота случаев ЦИН и РШМ у ВИЧ-инфицированных женщин и пациенток с подавленным иммунитетом вследствие трансплантации [84, 172].
Видимо, меньшую роль играют ВПЧ-специфические CD8(+) Т-клетки, т.к. они количественно преобладают на всех стадиях заболевания [173]. При тяжелой степени ЦИН и по мере прогрессии рака наблюдается значительное уменьшение соотношения CD4(+)/CD8(+) клеток как в очаге патологии [56], так и в периферической крови, в то время как остальные популяции лейкоцитов не претерпевают существенных количественных изменений [43]. Преобладание ВПЧ-специфических С1)8(+)-клсток