Очистка, физико-химические и регуляторные свойства изоформ сукцинатдегидрогеназы из штаммов Sphaerotilus natans с разным типом метаболизма при органо- и миксотрофном росте

• Автор: Ву Тхи Лоан
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Воронеж
• Количество страниц: 132 с. : ил.

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ТЕРМИНОВ
АДФ - аденозиндифосфат
АТФ - аденозинтрифосфат
ОА - оксалоацетат
СДГ - сукцинатдегидрогеназа
СУР - сукцинат : убихинон - редуктаза
СДГ 1 - быстродвижущаяся изоформа сукцинатдегидрогеназы
СДГ2 - медленнодвижущаяся изоформа сукцинатдегидрогеназы
СДГз - изоформа из штамма Д-
тРНК - транспортная рибонуклеиновая кислота
ФАД - флавинадениннуклеотид
ЦТК - цикл трикарбоновых кислот
ЩУК — щавелевоуксусная кислота
ЭДТА - этилендиаминтетраацетат
ЭТЦ - электронтранспортная цепь
<3, СоС> - убихинон
ЦТК - цикл трикарбоновых кислот
ГЦ - глиоксилатный цикл
АГ - аконитатгидратаза
ИДГ - изоцитратдегидрогеназа (НАДФ-зависимая)
МДГ - малатдегидрогеназа
ФГ - фумаратгидратаза
ЦС - цитратсинтаза
ПАА - полиакриламидный гель
ФМС - феназинметасульфат
НАД+ - никотинамидадениндинуклеотид

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Различные уровни организации белковой молекулы СДГ
1.1.1. Получение сукцинатдегидрогеназы из разных организмов
1.1.2. Структурная организация СДГ
1.1.3. Регуляторные аспекты функционирования фермента
1.2. Функциональное значение сукцинатдегидрогеназы у различных
организмов
1.2.1. Физиологическая роль комплекса II в растениях
1.2.2. Нарушения функционирования комплекса II
1.3. Сукцинатдегидрогеназа в прокариотических организмах
1.3.1. Функциональные особенности сукцинатдегидрогеназы
в бактериях
1.3.2. Структурная организация бактериальной сукцинатдегидрогеназы
1.3.3. Генетическая детерминация сукцинатдегидрогеназы из прокариот
1.4. Общая характеристика бактерий рода БрНаегоІіІш
1.4.1. Эколого-биохимическая характеристика бактерий У паїат
1.4.1.1. Экологические особенности
1.4.1.2. Особенности метаболизма БркаегоШиз пМат
Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1.1. Объект исследования
2.1.2. Методы исследования
2.1.2.1. Состав питательных сред для культивирования микроорганизмов
2.1.2.2. Определение активности сукцинатдегидрогеназы
2.1.2.3. Определение активности ключевых ферментов ЦТК и глиоксилатного цикла
2.1.2.4. Определение количества белка
2.1.2.5. Схема очистки сукцинатдегидрогеназы из БркаегоШт пагат штамм Д-
2.1.2.6. Проведение электрофоретических исследований
2.1.2.6.1. Аналитический электрофорез
2.1.2.6.2. Определение гомогенности препаратов изоформ сукцинатдегидрогеназы
2.1.2.6.3. Специфическое проявление сукцинатдегидрогеназы
2.1.2.7. Определение молекулярной массы нативного фермента
2.1.2.8. Определение молекулярной массы субъединиц СДГ
2.1.2.9. Исследование кинетических характеристик и регуляции активности фермента
2.1.3. Статистическая обработка экспериментальных данных
2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
2.2.1. Активность ключевых ферментов цикла трикарбоновых кислот и глиоксилатного пути в бактериях БркаегоШш na.ta.ns
штамм Д-507 и Д-380 при разных типах питания
2.2.2. Изоферментный состав СДГ бактерий БркаегоШш па!ат штамм Д-507 и Д-380 при органотрофном и миксотрофном росте
2.2.3. Очистка изоформ СДГ из исследуемых бактерий
2.2.4. Исследование на гомогенность полученных препаратов сукцинатдегидрогеназы
2.2.5. Определение молекулярной массы и субъединичного строения изоформ сукцинатдегидрогеназы
2.2.5.1. Определение молекулярной массы нативной молекулы
сукцинатдегидрогеназы с помощью гель-хроматографии на сефадексе

белки (12,2 %), липиды (1-3 %), а также гетерополисахариды [72, 137, 152]. Клетки бактерий рода БркаегоШш размножаются поперечным делением.
Одиночные или сдвоенные клетки (гонидии) отделяются от чехла и передвигаются при помощи пучка монополярных жгутиков. Чехлы обычно тонкие без включений оксидов железа и марганца. Они не всегда могут быть идентифицированы, когда полностью заполнены клетками, однако, если часть чехла свободна от клеток, идентификация организма значительно упрощается.
Представители рода ЗркаегоШш обладают вариабельным метаболизмом. Наряду с органотрофным, многие штаммы способны также к литогетеротрофному и миксотрофному росту с использованием
восстановленных соединений серы в качестве доноров электронов в энергетическом метаболизме. Наличие вариабильного метаболизма является одним из важнейших адаптационных механизмов, обеспечивающих
расширение их ареала и определяющих массовое развитие в новых
местообитаниях - сульфидных источниках [58, 73].
Для ЗркаегоШш характерен строго дыхательный тип метаболизма с кислородом в качестве терминального акцептора электронов. Эти
микроорганизмы способны расти при очень низких концентрациях растворенного кислорода (меньше 0,1 мг/л) в диапазоне температур от 10 до 40 °С (температурный оптимум 20-30 °С) при pH 6,5-7,5.
Среди них встречаются хемоорганогетеротрофы и литотрофы, источниками углерода и энергии для которых служат спирты, органические кислоты и сахара, а для некоторых обитателей целлюлозно-бумажных фабрик - также целлюлоза и крахмал. Соли аммония и нитраты могут использоваться в качестве источников азота в присутствии витамина В]2 или метионина [158]. Наличие в среде пептона, гидролизата казеина, смеси аспарагиновой и глутаминовой кислот и витамина В12 или метионина обеспечивают лучший рост бактерий [8, 9].